Section 1-3 고정 Fixation

Section 1-3 고정 Fixation

고정 (Fixation) • 정의 • 고정은 단백질을 안정화시켜 그 후 발생할 수 있는 변화에 저항할 수 있도록 조직을 변화시킨다. 이 변화는 화학적(고정액) 또는 물리적 방법(열, 건조, 동결)으로 이루어지며 이 과정을 변성(denaturation)이라 한다. • 절취된 조직을 물리, 화학적인 방법을 이용하여 조직의 변화와, 증명하려는 구성성분의 유실이나 존재 위치가 변형되는 것을 방지하여 표본 제작에 적합한 상태가 되도록 인위적으로 변형시키는 과정을 고정(fixation)

고정 (Fixation) • 고정의 5대 목적 • ⅰ) 보존효과 (preservation : autolysis (자가융해)의방지 - 가수분해 효소를 불활성화) • ⅱ) 치사작용 (killing : 살해, 세포의 기능을 정지), • ⅲ) 침투작용 (penetration : 조직 내부로의 고정액 확산), • ⅳ) 경화작용 (hardening : 유동성인 원형질의 반고체화, sol → gel) • ⅴ) 매염작용 (mordanting action : 염색단계에서 염색을 잘 되게 하는 작용) 이다.

고정제의 종류 • 응고형 고정제 • 세포내 단백질 분자의 기(group)가 서로 결합하고 엉겨 붙어 단백질 응고 (coagulation)가 일어나는 고정액으로서 조직내 가는 섬유상의 단백질을 그물 형태로 변화시키고, 박절하기에 적당한 경도를 주며, paraffin이 조직내로 쉽게 침투

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Mercuric chloride (승홍, 염화 제2수은,HgCl2) • 유독성 및 금속 부식성의 백색 결정체 • 장점 : 매우 강한 단백질의 고정과 매염작용으로 인한 염색성의 증가 • 단점 : 세포를 심하게 위축시키고, 침투가 느리지만 오랜 시간 고정 시 조직이 상당히 경화되는 작용이 있어 비교적 작은 조직편의 고정에 사용 • 승홍이 포함된 복합고정액은 Zenker’s, Helly, Maximow, Heidenhain susa, Schaudinn solution 등

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Mercuric chloride (승홍, 염화 제2수은,HgCl2) • 승홍으로 고정한 조직표본은 수은성의 침전물 즉 금속성 수은 또는 감홍(HgCl)으로 된 결정상 작은 흑색과립이 나타나는데 이는 염색 전에 Lugol's iodine과 5% sodium thiosulfate 과정을 거쳐 제거 Mercuric pigment

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Picric acid (피크린산) • 고정제와 염색에 모두 사용되는 유일한 물질 • Nucleoprotein을 매우 강하게 응고시키지만 DNA는 가수분해시키는 강한 산성물질 • DNA and RNA를 염색할 때는 picric acid 가 첨가된 고정액은 피하라. • 조직의 침투가 느리며, 세포를 심하게 위축시키기 때문에 단독 고정액으로 사용하지 않고 보통 다른 고정제(formalin, acetic acid, mercuric chloride 등)와 혼합하여 사용

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Picric acid (피크린산) • 피그린산이 포함된 고정액은 Boϋin, Rossmann, Gendre, Duboscque-Brazil solution 등 • 고정된 조직은 황색을 띠어 염색을 방해 → lithium carbonate를 70% alcohol에 포화시킨 용액으로 처리

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Chromium trioxide (무수크롬산, CrO3) • 적갈색의 결정물로 강한 단백질 응고작용 • 조직에 침투되는 성질이 느리고, 고정 후 수세를 8~12시간 충분히 해야 제거 • 수세가 불충분하여 조직내에 CrO3가 남게 되면, chromium tetroxide가 alcohol과 반응하여 녹색의 불용성인 chromium oxide로 변화되어 조직과정에 영향

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Ethanol (ethylalcohol) • water-soluble 조직의 구성요소 (glycogen, urate crystal)의 보존에 이용 • fat을 용해시키며, 조직을 overhardness와수축 • 고정기전은 조직 내 유리수 또는 결합수의 분자가 ethanol에 의해 치환되어 조직이 탈수 • 단백질이 응고되고 조직의 침투가 빠르지만 alcohol의 농도에 비례하여 조직의 경화 및 위축이 심하게 발생 • Alcohol에 고정하면 고정과 동시에 탈수되기 때문에 탈수과정이 필요없다.

고정제의 종류 • 응고형 고정제의 종류 • Aceton (CH3COCH3) • enzyme 특히 효소 (acid and alkaline phosphatase)를 조직학적으로 증명할 때 사용 • 고정은 냉장온도 (cold aceton (0~4℃))에서 빨리 고정하여야 하며 동시에 탈수도 이루어지므로 총 고정과 조직처리 시간은 많이 감소 • 매우 빠른 고정 작용을 보이나 심하게 shrinkage, distortion, overhardening에 주의

고정제의 종류 • 비응고형 고정제 (가교형 고정제) • 유리된 단백구조에 그 분자 내 결합을 나타낸 기가 표면에 표출하여, 그것들의 기와 고정액 사이에 화학반응이 일어나 거대한 망상분자 덩어리가 되어 단백질을 변성시켜 고정시키는 것으로, 단백질이 가수분해되어 peptide 결합이 분해되어 고정 • 가는 그물형태의 조직단백질 구조에 변화가 적어 세포의 미세구조 관찰에 적합

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Formalin (formaldehyde, HCHO) • 100% formalin은 무색의 formaldehyde gas 37~40%가 물에 녹아있는 상태 (10% formalin or 3.7% to 4% formaldehyde) • 고정반응의 주요부위는 protein chains에 연결되어 methylene bridges를 형성한 amino acids의 side chains 에 있는 amino group

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Formalin (formaldehyde, HCHO) • Lipids는 formaldehyde에 의해 보존되며, 탄수화물을 고정하지는 못하나 조직에 glycogen(당원)이 많이 존재할 때 proteins을 안정화하고(stabilizes) 고정 • 빛에 의해서 formaldehyde로부터 포름산(formic acid)이 발생할 수 있어서 미세구조의 보존 상태가 좋지 않기 때문에 전자현미경검사에는 부적당 • 공기중의 산소(O2)에 의해 formic acid 로 산화되므로 이를 방지하기 위해서는 산화방지제를 첨가

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Formalin (formaldehyde, HCHO) • 포름산(HCOOH)은 혈액이 풍부한 조직 내에 포함된 적혈구가 용혈되어 나온 혈색소(hemoglobin)와 결합하여 갈색의 산헤마틴(acid hematin)이란 과립(artifact)을 생성하는데 이를 포르말린 색소 (formalin pigment)라 한다.

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Formalin (formaldehyde, HCHO) • 산성화된 포르말린의 산화방지제로 lithium carbonate(탄산리튬), sodium carbonate (탄산나트륨), calcium carbonate, magnesium carbonate 등이 있으나 근원적으로 막기 위해서는 10% 인산완충액 (neutral buffered formalin:NBF)을 제조하여 사용 • 살균력이 있어 방부제로도 이용되며 값이 싸고 조직 내 침투력이 강하며 고정이 양호하여 조직병리 분야에서 가장 널리 사용하는 고정액 • 조직침투력은 실온에서 1시간에 약 1mm 정도이며, 가온 및 진탕 시는 고정이 촉진

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Potassium dichromate (중크롬산칼륨) • 크롬친화성조직, 골지체, 유사분열상, 적혈구 등의 보존에 우수 • 단점 : 조직의 침투가 느리고 멜라닌 색소가 표백되고, glycogen이 잘 보존되지 않아 단독으로는 거의 사용되지 않고 복합고정액의 한 성분으로 첨가 • 중크롬산칼륨이 포함된 고정액으로는 Müller, Regaud, Orth solution

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Acetic acid(CH3COOH) • 주요 작용은 nucleoprotein의 precipitation과 preservation에 있다 – nuclei을 고정하는 능력이 있으므로 많은 고정에서 첨가하여 사용 • 세포구성 성분을 팽창시켜 단독으로는 사용되지 않고, 조직을 위축시키는 성질이 있는 picric acid나 mercuric chloride와 혼합하여 사용 • mitochondria와 Golgi body는 파괴

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Osmium tetroxide (OSO4) • Lipids의 보존에 잘 되므로 Osmium은 paraffin processing 동안에 조직에서 지방을 유지할 수 있기 때문에 fat의 small amounts를 검출하는데 사용 • 복합지질, 지방 등을 잘 고정하며 이 물질에 산화되면 검은색으로 나타난다. • 주로 세포의 미세구조 혹은 세포 포함물과 같은 매우 작은 미세구조를 관찰하는데 효과가 있어서 glutaldehyde와 함께 전자현미경을 위한 후 고정액 (2차 고정액, postfixative) 으로 주로 사용

고정제의 종류 • 비응고형 고정제의 종류 • Glutaraldehyde • molecule의 각 끝부분에 하나의 aldehyde group 이 붙어있는 dialdehyde 인 점이 formaldehyde 와의 차이 • penetrates slowly and pooly • 전자현미경을 위한 고정에 주로 이용되며, 그것은 다른 aldehydes 보다 미세구조의보존에 좋기 때문 • periodic acid- Schiff (PAS) stain과 같은 Schiff reagent를이용하는 염색에는 glutaraldehyde-fixed은 false-positive를 얻을 수 있기 때문에 이용하여서는 안된다.

복합 고정액 • Formalin계 고정액 • 가장 보편적으로 사용되는 고정액이며, 가장 중요한 작용은 단백질분자의 amino group 사이에 methylene bridge를 형성하는 중합 작용으로, 단백질이 gel 상태로 변한다. • 고정 후 6~12시간 이내로 수세하면 이 결합은 다시 원래대로 전환 • 장점 • 값이 싸며 제조하기가 쉽고 비교적 안정하며 (완충액의 상태), 대부분의 염색에 특별한 전처리 과정이 필요치 않아 가장 널리 사용된다. • formalin에 고정된 조직은 동결절편의 제작이 쉬우며, 지방이나 효소의 보존에 우수

복합 고정액 • Formalin계 고정액 • 단점 • 취급 시 피부에 자주 접촉하면 피부염을 일으키고 증발된 기체는 강한 자극성 냄새가 난다. • 혈액이 많이 함유된 조직을 산성화된 formalin 용액에 고정하면 acid formaldehyde hematein의 형성으로 갈색의 인공색소가 침착되며 이중굴절을 나타낸다. • 종류 • 10% 인산염 완충 중성 formalin (NBF : Neutral Buffered Formalin) • 10% Formol-saline 용액 • Formol-alcohol 용액 • Paraformaldehyde 용액

복합 고정액 • Alcohol계 고정액 • Absoluteethanol은 당원(glycogen)의 보존에 사용되며, absolutemethanol은 세포도말 표본이나 날인표본에 사용 • 장점 • 신속한 고정효과를 가지고 있으며 RNA나 당원(glycogen) 등을 30분~2시간 이내에 탈수 및 고정 • 단점 • 적혈구가 용해되며, 너무 오래 고정하면 조직이 심하게 위축된다. 지질이 용해되므로 항산성 간균이나 수초(myelin)의 증명에 사용할 수 없다.

복합 고정액 • Alcohol계 고정액 • 종류 • Carnoy’s solution : Absolute alcohol + Chloroform + Glacial acetic acid • ⇒ 적혈구를 용해시킨다. • ⇒ 빠른 고정작용, 당원의 보존과 핵의 보존에 • 좋다. • ⇒ not be prolonged beyond 4 hours

복합 고정액 • Picric acid계 고정액 • 조직을 수축시키는 작용이 있기 때문에 세포를 팽창시키는 glacial acetic acid의 첨가로 조직의 균형을 주어야 한다. • 장점 • 당원의 증명에 좋으며, 조직에 신속히 침투 • 특히 Masson's trichrome, Mallory's PTAH 등의 염색에 우수 • 단점 • 적혈구를 용해 • DNA의 증명에 사용되는 Feulgen 반응에는 핵단백질이 가수분해되기 때문에 절대 금물

복합 고정액 • Picric acid계 고정액 • 종류 • Boüin solution : Picric acid 포화 수용액 + 40% formalin + Glacial acetic acid • ⇒ picric acid는 조직을 수축시키기 때문에 • 조직을 팽창시키는 acetic acid 와 함께 사용 • ⇒ acetic acid 로 인해 적혈구는 용해 • ⇒ excellent for trichrome stain • Dubosque-Brazil (D.B) solution : 80% ethanol + 40% Formalin + Picric acid • ⇒ 신장의 침생검의 고정에 우수

복합 고정액 • Mercuric chloride (HgCl2)계 고정액 • 중금속 고정제 중 가장 많이 사용 • Mercuric ion은 주로 단백질의 carboxyl group과 결합 • 장점 • 경색 또는 울혈이 발생한 조직 및 비장과 같이 혈액이 풍부한 조직의 고정에 우수 • 단점 • 금속을 부식하는 성질이 있으므로 금속제 기구의 사용을 금한다. • 조직이 심하게 위축되므로 대부분의 빙초산을 첨가 • 동결절편의 제작이 어려우며, 고정후의 조직에 흑색 침전물이 침착

복합 고정액 • Mercuric chloride (HgCl2)계 고정액 • 종류 • Zenker solution • Potassium dichromate + Sodiun sulfate + Mercuric chloride + D.W. • 사용 직전 Zenker 원액 95ml에 빙초산 5ml를 첨가하여 사용 • 고정 후에는 반드시 mercury pigment를 처리 • acetic acid로 인해 erythrocytes를 lysis

복합 고정액 • Mercuric chloride (HgCl2)계 고정액 • 종류 • Helly solution • Zenker 원액 + Formalin 37~40% • erythrocytes를 잘 보존하지만 Zenker solution은 acetic acid 가 있어 nuclear fixative는 더 좋다. • 고정 후에는 반드시 mercury pigment를 처리 • Heidenhain 'Susa" solution • B-5 용액 • Maximow sol, Schaudinn sol

복합 고정액 • 중크롬산(dichromate)계 고정액 • 수용액내에서 Cr-O-Cr 복합체로 전환 • 부신수질(adrena medulla)의 chromatin granule을 증명할 때 필히 사용 • 장점 • 크롬친화성 조직, 사립체, 골지체, 적혈구의 보존에 우수 • 단점 • 당원의 보존이 나쁘며, 산화작용 때문에 PAS 반응의 강도가 저하 • 오래 고정하면 멜라닌 색소가 산화에 의해 표백

복합 고정액 • 중크롬산(dichromate)계 고정액 • 종류 • Müller solution • Regaud solution • Orth’s solution • potassium dichromate를 함유하고 있는 고정액은 고정 후에 반드시 수세하여야 하고, 고정 시간은 조절되어야 하며, 수세 후에 wet tissue 는 70% to 80% alcohol에 보관

복합 고정액 • Osmiun계 고정액 • Osmic acid는 주로 전자현미경 검사의 후 고정액 (post-fixative)으로 사용 • 불포화지질과 결합하여 지질이 지용제에 녹지 않게 된다. • 장점 • 전자 현미경 검사를 위한 조직의 고정 및 지질의 고정에 우수 • 단점 • 값이 비싸며 침투가 느리고 조직을 검게 착색하므로 대조염색을 하기가 어렵다. 독성이 강하기 때문에 환기장치가 잘된 장소에서 취급

복합 고정액 • Osmiun계 고정액 • 종류 • Flemming solution • 2% Osmium tetroxide + 1% Chromium trioxide + Glacial acetic acid • 12~24시간 고정하고 물에 수세한 다음 80% alcohol에 보관 • Champy solution • Altman solution

특수 고정액 • Electron-microscopy fixative • 전고정제로서 2% glutaldehyde (pH 7.2~7.4), 후고정제로 서 1~2% Osmium tetroxide 용액 • 박물표본을 위한 고정액 • Kaiserling solution • 방법은 Kaiserling Ⅰ고정에 1~5일간 고정하고 Ⅱ액에 1~6시간 두어 원래의 조직의 색을 재현시킨 후 Ⅲ액으로 옮기면 영구히 마르지도 않고 변하지도 않는다(본래의 색 유지). • 전시용 박물표본(museum preparation)을 제작하여 영구보존 해야 할 경우

고정의 형태 • 화학적 고정 • 침수고정 (immersion fixation, 담금고정) • 고정액에 조직을 침수시켜 단백질을 변성 • 대부분의 조직은 이 방법에 의해 고정 • 관류고정(perfusion fixation) • 고정액의 침투속도가 느린 경우 고안 • 조직괴 내부도 균일하게 고정을 유도 • 특수한 장기, 뇌, 폐, 췌장 등은 관류고정 • 자주 사용되는 관류고정액으로는 4% glutaraldehyde 인산염 완충액 • 관류 시간은 생체나 그 국소부위의 크기에 따라 다르지만 보통 5~20분이 적당

Section 1-3 고정 Fixation