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实验十二、透射电镜标本制备方法

实验十二、透射电镜标本制备方法. （选作）. 透射电镜（ TEM ） 透射电镜即透射电子显微镜（ Transmission Electron Microscope ，简称 TEM ），通常称作电子显微镜或电镜（ EM ），是使用最为广泛的一类电镜。. 透射电子显微镜. 莱卡超薄切片机. JEM-1011 透射电子显微镜. 玻璃刀制作仪. 透射电镜工作原理 ： 利用电子射线（或称电子束也称电子波）穿透样品，而后经多级电子放大后成像于荧光屏。 主要优点 ：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。. 透射电镜标本制备方法.

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实验十二、透射电镜标本制备方法

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  1. 实验十二、透射电镜标本制备方法 （选作）

  2. 透射电镜（TEM） 透射电镜即透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM），通常称作电子显微镜或电镜（EM），是使用最为广泛的一类电镜。

  3. 透射电子显微镜 莱卡超薄切片机 JEM-1011透射电子显微镜 玻璃刀制作仪

  4. 透射电镜工作原理： 利用电子射线（或称电子束也称电子波）穿透样品，而后经多级电子放大后成像于荧光屏。 主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。

  5. 透射电镜标本制备方法 薄片（〈1000埃） 1 制备硬标本块儿后超薄切片（最常规） 2 溶液成膜（颗粒〈1000埃： 细胞碎片，病毒，生物大分子） 3 复型薄膜（在组织细胞表面或裂面喷上一层金属膜，将膜剥离后观察）

  6. ξ1制备硬标本块后超薄切片 • 冰冻块切片： 简便，快，结构保存相对差，价格贵 • 树脂块切片 复杂，慢，结构保存较好，价格相对便宜

  7. 树脂块的制备 1 取材与固定 [目的] 将所取样本尽可能固定在生活状态下 固定剂： • 戊二醛（醛基和氨基反应） • 四氧化锇（锇与双键螯合） • 多聚甲醛（醛基和氨基反应） 固定效果：戊二醛优于多聚甲醛

  8. N O + NH2 HC HC （西佛碱） 醛基和氨基反应 醛醇反应 适合保存：蛋白质，核酸，多糖 不适合保存：脂类 分子量较小，渗透较快

  9. 锇与双键反应 适合保存：脂类（蛋白质也可以） 不适合保存：核酸，多糖 分子量较大，渗透能力弱，均匀快速的固定局限于0.25mm(块〈0.5mm立方) 长时间固定组织块易脆

  10. 多用双固定：戊二醛+四氧化锇(两步或一步) 块不能太大〈1mm立方

  11. 固定液=固定剂+缓冲液 缓冲液：维持pH, 渗透压 0.1M磷酸缓冲液（PB） 固定剂浓度： 戊二醛（GA）：3%（ 0.1M PB ） 四氧化锇(锇酸):1% （ 0.1M PB ） 多聚甲醛（FA）:4% （ 0.1M PB ） 2.5%戊二醛+2%多聚甲醛（ 0.1M PB ） 1%戊二醛+1%四氧化锇（ 0.08M PB ）

  12. 固定方法（迅速）： 原位固定 （一些不便于迅速摘取的组织） 灌流固定后取材（通过血液循环的途径将固定液引入到要固定的组织中，适用于离体后会变形变性的组织，例如肺泡，对缺氧比较敏感的脑组织等，注意选择最短的循环途径） 取材后固定

  13. [小]，[冷]， [快] • 将动物麻醉或急性处死，暴露所需器官 • 剪取小块组织，放在预先冷却的固定液中 • 在洁净纸片上滴一滴冷却的固定液，取出组织块初步修块 • （细长条：L：2-3mm,W：1mm） • 转移回冷却的固定液中

  14. 常规（两步固定法） • GA固定液中4°C 1~2h(中间0.5-1h可取出修块) • 转移到冲洗液中（0.18M蔗糖in0.1MPB） 4°C 1~2h(原则上与固定时间相等)，中间换液2次 • 锇酸固定液中4°C或R.T.1h • dd水中冲洗 • *在冲洗液中可存放1~2周，但每周至少换一次液（在固定液中长放易脆） • *经GA固定后膜还有一定的渗透作用，在经锇酸固定后就没有了 • *清洗要充分（GA与锇酸会产生微细沉淀，一般两个固定液间更换两次冲洗液后第三次过夜；锇酸与乙醇会产生微细沉淀）

  15. 2 脱水 • [目的]去除样品中的水，为包埋剂（非水溶性）的均匀浸透做准备 • 脱水剂：乙醇或丙酮（梯度脱水）

  16. *低浓度时对组织有提取作用，时间不可长 • *低温可降低提取作用，但100%低温会吸水 • *可停在90%过夜，不能在100%，脆 • 时常摇动 • *100%加干燥剂保存在干燥器中

  17. 3 浸透与包埋 [目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 包埋剂： （几类物质的混合物） • 环氧树脂（基本成分） • 氨类物质（催化剂） • 酸酐（交联）固化剂 • 临苯二甲酸二丁酯（增塑剂）

  18. 包埋原理 包埋剂的基本要求 EPON 812

  19. *不要加盖 *R.T.下干燥器中可保存相当长时间

  20. 4 修块与切片 0.1*0.1mm 90度 梯形

  21. 玻璃刀（现做现用，20-30片） • 钻石刀 • 切片机的工作原理： 金属膨胀杆 • 切片厚度与颜色 *环氧

  22. 支持网与支持膜 • 铜网 • 不锈钢网 3mm 目数 • 镍网 • 金网 • 聚乙烯醇缩甲醛膜（Formvar）（0.2-0.5% in 氯仿） • 聚乙烯醇缩丁醛膜 • 火棉胶膜（1－4％in醋酸戊酯） • 碳膜 *切片保存

  23. 5 染色 [目的]将重金属原子结合到细胞结构上使造成图像反差 重金属：铅盐（Pb,82）蛋白质，糖元，脂类（膜看得清楚） 铀盐（U,92） 大多数细胞成分均可，特易于核酸 复染

  24. 醋酸铀（黄色有毒晶体，见光分解） • 50-70%乙醇饱和溶液，放置过夜，取上清 • 避光（棕色光口瓶，黑纸罩上） • 柠檬酸铅（有毒） • {1.33g硝酸铅+1.76柠檬酸钠（2水）}in 50ml dd水+浓NaOH数滴 • 避CO2（水去CO2，口吹， NaOH 颗粒） • 醋酸铀30m，漂洗 • 柠檬酸铅3~7m（不宜过长），漂洗 • 0.02N NaOH分色，漂洗 • *染液配好后可使用半年左右，放置较久的染液离心一下效果好

  25. 半薄切片 [对于不均匀的组织重要] • 厚度0.5微米（介于光与超薄之间） 载玻片水滴上70-80 °C展开，烤干 • 相差显微镜观察 • 经甲苯胺兰（1%）染色后观察，可用无水乙醇分色

  26. ξ2溶液成膜 [对象]分散颗粒〈1000埃： 细胞碎片，病毒，生物大分子 适当溶液浓度 悬滴法，喷雾法 负染或投影（增加反差） 磷钨酸钠或钾（1~2%水溶液）

  27. 甲型流感病毒，多形态性（园，椭圆，丝状体），外膜有放射状排列的纤突甲型流感病毒，多形态性（园，椭圆，丝状体），外膜有放射状排列的纤突

  28. ξ3复型薄膜 ER 内质网 M 线粒体

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