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Les virus comme vecteurs thérapeutiques

Les virus comme vecteurs thérapeutiques. Par Patrick Salmon chercheur au Département de Microbiologie et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève. Thérapie génique: quelques applications. Parkinson, Huntington. Mucoviscidose. Hypercholestérolémie Hémophilie. Immunodéficiences

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Les virus comme vecteurs thérapeutiques

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Presentation Transcript

  1. Les virus comme vecteurs thérapeutiques Par Patrick Salmon chercheur au Département de Microbiologie et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève

  2. Thérapie génique: quelques applications Parkinson, Huntington Mucoviscidose Hypercholestérolémie Hémophilie Immunodéficiences Anémies Dystrophies

  3. Questions à se poser lorsqu’on envisage une thérapie génique Ou… WWW.genetherapy.com

  4. WWW.genetherapy.com What? Where? When?

  5. WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer? Quelle est la taille de sa séquence codante? WHERE? Quelles sont les cellules à cibler? WHEN? Combien de temps le transgène doit-il être exprimé? Son expression doit-elle être régulée?

  6. Maladies candidates pour la thérapie génique MALADIE HEREDITAIRES PathologieDéfaut génétiquePrévalenceCible thérapeutique Immunodéficience ADA, X-SCID rare CSH ou lympho T Hémophilie A facteur VIII 1: 10.000 mâles foie, muscle Hémophilie B facteur IX 1: 30.000 mâles CSH, fibroblaste Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1:1.000.000 foie familiale Mucoviscidose CFTR (transporteur 1:3.000 cauc. poumon des ions chlores) Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSH anémie falciforme, thalassémie Maladie de Gaucher glucocérébrosidase 1:450 (éthnie!) CSH Emphysème héréditaire a-1 antitrypsine 1:3.500 foie et poumon

  7. Maladies candidates pour la thérapie génique MALADIE ACQUISES Pathologie Prévalence Cible thérapeutique Cancer 1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes maladies dégénératives: Parkinson 1 million aux USA Alzheimer 4 millions aux USA neurones, cellules gliales désordres « immunologiques »: diabète de type I dizaines de millions cellules b du pancréas, autres… Cardiovasculaire: resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires maladies infectieuses: SIDA, hépatite B ou C centaines de millions CSH, hépatocytes

  8. Le vecteur idéal • Est défini par les exigences thérapeutiques • (expression stable ou transitoire). • Peut atteindre de hautes concentrations permettant l’infection • de nombreuses cellules. • Est aisément produit par des techniques reproductibles. • Pour l'expression à long terme, est intégré dans un site spécifique • du chromosome, ou persiste en épisome stable. • Possède une unité transcriptionelle contrôlable. • Cible certaines cellules spécifiquement. • Est dénué de composants induisant une réponse immunitaire. • MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent adéquat...

  9. Thérapie génique: in ou ex? Isolation Vecteur Cellules Injection Vecteur Transplantation Cellules Génétiquement Modifiées In vivo Ex vivo

  10. Vecteurs pour la thérapie génique • Viraux • adénovirus • virus adéno-associé (AAV) • rétrovirus: oncorétrovirus • lentivirus • virus herpes • virus à ARN (polio, sendaï, etc…) • Non viraux • ADN nu • liposomes

  11. Vecteurs viraux

  12. Vecteurs viraux

  13. Adénovirus Rétrovirus AAV Trois familles de virus utilisés pour le développement de vecteurs

  14. Adénovirus AAAH! Grande capacité (30-40 kb) Facile à produire à hauts titres Infecte les cellules non-mitotiques Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 70-90 nm OOOOH… Ne s’intègre pas Immunogénique (moins si « éviscéré ») Peut induire une « acute phase response »

  15. AAV AAAH! Infecte les cellules non-mitotiques LE VIRUS s’intègre à un site spécifique Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 20-30 nm OOOOH… Faible capacité (4 kb) Difficulté de production (« dependovirus! ») LE VECTEUR s’intègre au hasard Immunogénicité conditionnée par la contamination par le virus helper

  16. Retrovirus AAAH! Capacité raisonnable (10 kb) Facilité de production adéquate Infecte les cellules non-mitotiques (LENTIVIRUS) S’intègre Pas de transfert de séquences codantes virales Enveloppé Génome: ARN-ADN Taille: 90-120 nm OOOOH… S’intègre au hasard N’infecte pas les cellules non-mitotiques (ONCORETROVIRUS)

  17. Cycle de réplication du HIV Fusion Modifications Post-traductionnelles Synthèse Proteines decapsidation Attachement Maturation Export Nucléaire Retro- Transcription Assemblage bourgeonnement Transcription Import Nucléaire Intégration CD4 CCR5 CXCR4

  18. Transduction par vecteur lentiviral Fusion / Décapsidation Rétro-Transcription Import Nucléaire Attachement Intégration Expression Endocytose

  19. Quelques dates marquantes… 1996: Un vecteur lentiviral peut effectuer le transfert, l’intégration et l’expression à long terme un gène dans les neurones in vivo. 1998: Transduction stable de CSH humaines capables de reconstituer des souris NOD/SCID. 2000: Traitement de la mucopolysacharidose, du Parkinson et de la thalassemie dans des rongeurs. 2002: transgenèse avec vecteur lentiviral. 2003: Premier essai clinique avec un vecteur lentiviral.

  20. polyA polyA polyA polyA NEF VPR VPU GAG VIF POL LTR Génome HIV-1 LTR T A T R E V Plasmides d’empaquetage lentivecteurs: NEF VPR VPU GAG VIF 1e génération CMV POL T A T R E V GAG CMV POL 2e génération T A T R E V GAG CMV POL 3e génération RSV REV

  21. Vecteur de transfert vpu nef gag vif RRE env vpr tat rev pol cPPT Y LTR LTR dPPT rev éléments actifs en cis LTR LTR RRE dPPT Y cPPT SA SD Capacité: 10 kb

  22. Prototypes de lentivecteurs SIN SIN SIN SIN WPRE WPRE WPRE WPRE SIN SIN SIN SIN SIN SIN RRE cPPT Y Ubiquiste EF1-a Gene X RRE cPPT Spécifique Y gp91phox Gene X RRE cPPT Inductible Y Tet-O Gene X RRE cPPT Y Bicistronique Gene X Gene Y RRE cPPT Y Inhibiteur Gene X sihRNA sihRNA U6 U6

  23. RRE cPPT Y Gene X LTR LTR WPRE Production de lentivecteurs GAG POL CMV An REV RSV An 293T VSV G CMV An 50 TU/cellule x jour

  24. Lignée stable productrice de lentivecteurs RRE cPPT Y Gene X LTR LTR WPRE GAG POL CMV An REV Tet An VSV G Tet An Dox 30 TU/cellule x jour

  25. Titration d’un vecteur lentiviral • Titration provirale: • real time QPCR • 2. Expression du trangène: • FACS, etc… • Décompte des particules: • p24-CA • Décompte des génomes: • real-time QPCR

  26. Applications

  27. Hepatocytes comme cibles de thérapie génique Pour le traitement de maladies hépatiques Crigler-Najjar type I (Bilirubine UDP-Glucuronosyl transferase) Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl acetoacetate hydrolase) Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase) Maladie de Wilson (ATP 7B) Hépatite viral B ou C (Immunisation intracellulaire) Comme site de production de protéines systémiques Maladies génétiques hépatiques Emphysème (alpha-1 Antitrypsine) Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX) Trouble du métabolisme lipidique (Apolipoprotéines) Maladies génétiques non-hépatiques Diabète type I (Insulin, PDX-I) Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase) Thalassémie (Erythropoiétine)

  28. Hypercholestérolémie homozygote familiale (récepteur low-density lipoproteins -LDL-) Réimplantation Récolte Transfert de gène Culture Purification des hépatocytes Lobectomie 20%

  29. Gfp-LV, moi 10, with vit E 2x107 hep. 50% hepatectomy 1% 1% 5 wks 2 wks 70% hepatectomy x100 x100 x200 x200 FL2 31% 0.02% GFP

  30. Précurseur myeloide Migration (transdifferenciation?) Neutrophiles, monocytes CSH Précurseur Lymphoide Lymphocytes Précurseur érythroide Erythrocytes

  31. Précurseur myéloide Neutrophiles, monocytes IL-7 IL-15 IL-7 IL-15 IL-7 CSH Précurseur lymphoide Lymphocytes T Précurseur érythroide Erythrocytes

  32. Il-7 et homéostase des lymphocytes T Y JAK1 Y P P IL-7 IL-7Ra gc JAK3 PI3-K STAT5a Bad P-Bad STAT3 STAT5b Bcl-2 Bcl-X Cyt C Anti-apoptose Pro-differenciation

  33. X-SCID IL-7 IL-7 IL-15 Lymphocytes T IL-15 IL-7 CSH Précurseur lymphoide

  34. Chaîne g ILR LTR LTR Thérapie génique des « enfants bulles » Isolation des CSH Transduction Transplantation CSH Génétiquement Modifiées

  35. Chaîne g ILR LTR LTR Thérapie génique X-SCID Vecteur: MLV (oncorétrovirus) Cibles: ~ 2x108 cellules CD34+ activées Efficacité de transduction: ~ 30% Fraction de cellules sanguines positives pour le transgène: - lymphocytes T: ~ 100% - neutrophiles: ~ 0.1%

  36. Promoteur Transgène LTR LTR Oncogenèse par intégration Oncogène Effet “enhancer” Effet promoteur Oncogène

  37. Chaîne g ILR LTR LTR Leucémie post-thérapie génique X-SCID Exon 5 Exon 4 Promoteur LMO2 Exon 1 Exon 3 Exon 2

  38. IL-15 IL-7 IL-7 IL-7 IL-15 IL-7 IL-7 IL-15

  39. Thérapie génique X-SCID 11 enfants traités 1 sans réponse 2 leucémies (1 rémission, 1 rechute) 8 à la maison avec une vie normale

  40. Thérapie génique SCID-ADA 4 enfants traités 4 enfants guéris

  41. Conclusion: les vecteurs viraux peuvent être thérapeutiques, • MAIS…

  42. Quelques axes de recherche en thérapie génique • vectorologie (ex: ciblage) • toxicologie (ex: oncogenèse) • immunologie (ex: tolérization) • développement de modèles

  43. Exon 3 Exon 4 Promoteur Exon 1 Exon 2 Intégration des vecteurs rétroviraux HIV MLV

  44. Exon 3 Exon 4 Promoteur Exon 1 Exon 2 Intégration ciblée

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