La fluorescenza

1. La fluorescenza Una breve introduzione

2. La luminescenza Luminescenza:emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamente. Eccitazione chimica: Chemiluminescenza Eccitazione luminosa: fosforescenza fluorescenza

3. Fluorescenza e fosforescenza • I materiali fluorescenti cessano di essere luminosi al cessare dello stimolo che ne determina la luminosità • I materiali fosforescenticontinuano ad emettere la luce per un certo periodo dopo la fine dello stimolo

4. Esempi noti a tutti… • Detersivo “più bianco del bianco” • Discoteca: i denti ed i vestiti che “brillano” • Sveglie con il quadrante fluorescente • Formula 1: per determinare i punti di attrito fra aria ed auto • Inchiostri per banconote contro i falsari

5. • Che cosa succede alla luce che e’ stata assorbita da una molecola? L’energia della luce assorbita da un oggetto qualsiasi viene generalmente dissipata sotto forma di calore. Alcune sostanze invece liberano parte dell’energia assorbita attraverso l’emissione di luce di un colore diverso da quella assorbita (fluorescenza). Le molecole che assorbono non sempre fluorescono.

6. Cos’è la fluorescenza ? Emissione di radiazione da parte di una molecola eccitata. Il nome deriva dalla fluorite, minerale di calcio e fluoro, in cui è stato osservato per la prima volta il fenomeno 1) eccitazione 2) rilassamento 10-12 sdecadimento non radiativo isoenergetico fra stati di uguale molteplicità 3) decadimentonon radiativo 4) decadimento radiativo tra stati elettronici di uguale molteplicità Diagramma di Jablonski E1 } 10-9 s E0

7. Cos’è la fosforescenza? Stati elettronici eccitati Stato elettronico fondamentale E0

8. Quali sono le molecole fluorescenti? • Sono fluorescenti le molecole con sistemi ad elevata . coniugazione • Strutture con molti elettroni  coniugati • Strutture planari con anelli aromatici Esempi: fluoresceina, flavine,cianine, rodamine, porfirine.

9. O OH O COOH H2 N NH2 Br- + N N = C = S CH2 CH3 Fluorescein isothiocyanate ( FITC ) Alcuni esempi di molecole…. Ethidium Bromide

10. …..e di materiali pittorici • Molti dei materiali usati tradizionalmente in pittura presentano, anche se debole, una emissione per fluorescenza nel visibile. • L’emissione per fluorescenza dipende dal contributo degli strati più esterni dell’opera d’arte, ovvero dalle vernici (semi-trasparenti), e dagli strati dipinti, generalmente composti da leganti e pigmenti (bianco di zinco, lacca di garanza, giallo indiano), e dalle loro interazioni chimiche.

11. Giudizio Universale: immagine nel VIS (sinistra) e in fluorescenza indotta UV (destra):l'azzurro di lapislazzuli, utilizzato da Michelangelo, e' riconoscibile dalla presenza di una fluorescenza bianco-verdastra

12. Ricordate? Tecniche spettroscopiche in assorbimento

13. Diagramma schematico di uno strumento di fluorescenza Rivelatore lampada Monocromatore di eccitazione Monocromatore di emissione campione

14. Lampada Campione lecc. lem. Lente Monocromatore di eccitazione Lente Computer PMT “segnale” F Il fluorimetro (nm) Monocromatore di emissione

15. E2 Conversione interna E1 Fluorescenza Abs E0 Diagramma di Jablonski: conseguenze • Stokes shift (spostamento ad energie più basse). • Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione). • Regola dell’immagine speculare.

16. Informazioni ottenibili: • Concentrazione della sonda fluorescente (fluoroforo), fino a nM. • Numero e popolazione di specie presenti in soluzione. • Riconoscimento del materiale fluorescente sulla base dello spettro caratteristico di fluorescenza. • Possibilità didistinguere i diversi materiali, anche quando questi presentano lo stesso colore in condizioni di luce diurna. • Confrontando l’emissione di alcuni materiali noti con l’immagine di fluorescenza di un’opera d’arte, è in principio possibile classificare l’immagine, e localizzare sulla superficie i diversi materiali utilizzati.

17. L’intensità di fluorescenza da cosa dipende? • Dipende da: • Concentrazione di fluoroforo • Efficienza dell’assorbimento di radiazione (e) • Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica, )

18. Osservabili: intensità e resa quantica • L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da: • Intensità della lampada • Efficienza dei monocromatori • Banda passante utilizzata • Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore • Ossia dallo strumento con cui è stata determinata!!!! • Al contrario • l’assorbanza è una misura assoluta • la resa quantica è una misura assoluta standards

19. L’ esperienza di laboratorio…… • Spettri di fluorescenza in soluzione acquosa di alcune molecole fluorescenti • Verifica dello Stokes shift e delle regole di Kasha e dell’immagine speculare per i fluorofori analizzati. • Spettro di fluorescenza di una porfirina deposta su di una superficie (tecnica “front face”).

20. Abs 0.8 0.6 0.4 0.2 Ad esempio…… La 5,6-carbossifluoresceina… assorbimento…. fluorescenza….

21. Ricordate?

22. Anche in questo caso possiamo operare direttamente sull’opera d’arte

23. Applicazioni • Quando un’opera viene irradiata con una radiazione di lunghezza d’onda compresa nella regione dell’ultravioletto, tale radiazione viene in parte riflessa e in parte assorbita dagli strati superficiali. Parte dell’ energia assorbita viene quindi riemessa nuovamente per fluorescenza nella banda del visibile (400-700 nm). • La sua realizzazione èpratica e semplice: basta disporre di unalampada di Wood e oscurare l’ambiente dilavoro. • Vantaggi: • Metodo non invasivo • Risposta immediata

24. Qual’ è la sorgente luminosa? Serve una sorgente che emette radiazioni nell’UV Stesso particolare con una lampada di Wood e con un filtro passa alto a 470 nm per mettere in risalto la fluorescenza Particolare di un affresco del Parmigianino nella Cappella di San Giovanni, a Parma Stesso particolare illuminato da una lampada di Wood

25. La misura di fluorescenza • La sorgente luminosa usata per irradiare la superficie è una semplice lampada di Wood • L’immagine viene formata su di un sensore opportuno (carta fotografica) usando un normale obbiettivo fotografico o per telecamera • Un filtro nero davanti all’obbiettivo elimina le componenti visibili dalla radiazione

26. Utile per esaltare e rendere più leggibili scritte sbiadite dal tempo su documenti e manoscritti antichi.

30. La fluorescenza UV-VIS • E’ una tecnica ottica per ottenere immagini di superfici dipinte usando radiazione nella banda spettrale dell’ultravioletto • Si raccoglie la fluorescenza emessa dalla superficie • Se applicata all’analisi di dipinti antichi, può rivelare la presenza di vernici, leganti, coloranti o particolari pigmenti di restauro