320 likes | 482 Views
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka. Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym. Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka,
E N D
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Laboratoryjne metodywykrywaniawirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy
NOROWIRUS NOROVIRUS L L ROTAVIRUS ROTAWIRUS J ADENOVIRUS ADENOWIRUS EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka J Spożycie (z płynami) Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Kontakt (podczas mycia) Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Oddechowa Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Ocena ryzyka *Podstawy naukowe Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka Struktura ramowa analizy ryzyka Źródło: WHO Food Safety odpowiednie metody
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dzisiaj nie będę mówić o… Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach Liczba koloniiDIN EN ISO 6222 E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3 DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2 Pseudomonas DIN EN 12780 aeruginosa ... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody,badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka • badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNA • pobieranie próbek wody do analizy wirusów • oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu • filtra z włókna szklanego • ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa • rola inhibitorów środowiskowych • wykrywanie wirusów metodami PCR • badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej Phage MS2
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001 Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001 Fagi B. fragilisDIN EN ISO 10705-4:2001 Fagi F+RNA F-Pilus F+ Fagi somatyczne Bacterium Bacterium
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- FagiF+RNA Fagi somatyczne DIN 10705-1 10705-02 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- SzczepSalmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 ) Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholten‘s Agar (TYGA) ( MSA ) Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml 250 µg/ml Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml Fag wzorcowy:MS2PhiX174 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Morfologia płytek bakteriofagów Fag138 PRD1 PhiX174 MS2
C.Fuchs EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Morfologia płytek bakteriofagów Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego PhiX 174 Ar + Bri „Karta przewodnia”Kolifag somatyczny 110 100 90 80 70 pfu / ml 60 50 40 30 20 9.7.08 7.9.08 30.5.08 19.6.08 29.7.08 18.8.08 27.9.08 6.11.08 10.5.08 20.4.08 17.10.08 26.11.08 16.12.08 Data x-3s x-2s x x+2s x+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Monitorowanie wirusów – pobieranie prób Związki chemiczne Rozkład statystyczny Wirusy Skupiska!
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Próbobranie
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów 10-litrowa próba wody ( DNA / RNA ) próbka wody surowej Wykrywanie wirusa metodą PCR • Pobieranie prób wody o dużej objętości • Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) • Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów • Testy wykrywające wirusy Infectivity assays
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody Cechy wirusa Metody Polarność powierzchniowa kapsydu Adsorpcja / Wymywanie Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Gęstość Ultrawirowanie
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka W terenie…
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Włókno szklane – badania polowe dużych objętości Próba wody: 10 litrów 1000 litrów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie DNA i RNA liza elucja etapy mycia Bufor do lizy 2x 50 µl Bufor do elucji kroki powtarzane 5 razy Krzemionka Próbka 5ml 5 min 60°,1400 rpm
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi Wirus RNA Wirus DNA Zdjęcia:dzięki uprzejmości J.Y. Scro
Odwrotna transkrypcja EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Amplifikacja informacji genetycznej wirusów DNA RNA Białko 5’---CTCAGCGTTACCAT---3’ 3’---GAGTCGCAATGGTA---5’ 5’---CUCAGCGUUACCAU---3’ N---Leu-Ser-Val-Thr---C DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie wirusów metodami PCR konwencjonalne PCR (jakościowe) DNA / RNA PCR czasu rzeczywistego (ilościowe)
Wirusy DNA Wirusy RNA PCR RT-PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR)
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Nested (RT)-PCR NOROWIRUS (nested RT-PCR) ADENOWIRUS (nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R)
Adenowirus 41 wzorzec 102 - 106kopii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Real-Time TaqManTM PCR Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu • Potrzebne są tylko: (1) matryca(próbka DNA) • (2) nieoznaczona para dla starterów • (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana • 2 fluorochromami (np. reporter FAM iwygaszacz TAMRA) • (4) Mastermix (koktail odczynników)
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Real-time PCR 1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10 Testy / próbki: Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiskaczęsto negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie zakaźności adenowirusa • Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa • zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach • następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR) (A. Heim)
J L EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Metody wykrywania wirusa Metoda wykrywania Hodowla komórkowa RT-PCR ICC-PCR J J L Skraca czas wykrywania J J Wykrywa zakaźnego wirusa J L L Wykrywa jedynie żywe organizmy L J J Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli L J J Odporna na wpływ substancji hamujących PCR J J L O zwiększonej czułości
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie zakaźności enterowirusa a) TestTCID50b)Test łysinkowy kontrolnaCVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Podstawowe techniki monitorowania wirusów - wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA • systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) • systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności Techniki zaawansowane: - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dziękuję Państwu!