Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací

1. Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství

2. Mikroorganismy a průtoková cytometrie • Konstrukce cytometrů • Velikost – (detekce částic, intenzita odezvy, rel. fluorescenční odezva) • Tvar buněk • Minimum informací x rozmanitost mikroorganismů

3. Mikroorganismy • Saccharomyces cerevisiae • Pichia pastoris • produkční systém pro syntézu rekombinatních proteinů, indukovatelný silný promotor AOX • Thermus sp., T. ruber, T. aquaticus • biodegradační schopnosti, syntéza termostabilních enzymů

4. Hlavní body z biotechnologického pohledu • Růstová dynamika • Fyziologické změny • Morfologické znaky • Viabilita • Enzymová aktivita • Obsah intracelulárních složek

5. Morfologie • Cytometrie • Velikost - FSC, EV • Tvar - SSC • Mikroskopie + analýza obrazu • Velikost - plošný obsah • Tvar – šířka, délka, cirkularita,…

6. Morfologiecytometr x mikroskop

7. Fluorescenční značení - viabilita • Membránová integrita • Propidium jodid, ethidium bromid, Sytox green • Transmembránový potenciál • Rhodamin123, DiOC2(3), bis-oxonol • Enzymová aktivita • Fluorescein diacetát, karboxyfluorescein diacetát

8. Integrita buněčných membrán • Propidium jodid • náboj +2 • neproniká do prokaryotních ani eukaryotních buněk s intaktní membránou • červená fluorescence, 20 x vyšší po vazbě na NK • Ethidium bromid • náboj +1 • pomalu proniká buněčnými membránami • červená fluorescence, 20 x vyšší po vazbě na NK • Sytox green • z živých buněk plně vylučován • zelená fluorescence, 1000 x vyšší po vazbě na NK

9. Membránová integrita • Směs vitálních a fixovaných b. S. cerevisiae • PI • EB • Sytox

10. Transmembránový potenciál • Rhodamin 123 • Kladný náboj • Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu • Zelená i červená fluorescence • DiOC2(3) • Kladný náboj • Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu – změna intenzity červené fluorescence • Zelená i červená fluorescence • Bis-oxonol • Záporný náboj • Akumulace v depolarizovaných buňkách • Vazba na nepolární kompartmenty

11. DiOC2(3), Rhodamin 123 • Pichia - mix • Saccharomyces - mix • Thermus • vitální • fixované

12. BOX

13. Esterázová aktivita • Fluorescein diacetát • lipofilní, nenabitá a nefluorescentní sonda, • snadno prochází buněčnými membránami, • v buňkách je hydrolyzována nespecifickými esterázami na anion fluoresceinu • špatná retence v buňkách • Karboxyfluorescein diacetát • podobné vlastnosti jako FDA • větší molekula, hůř prochází neporušenými membránami • lepší zádrž produktu v buňce

14. FDA - viabilita Saccharomyces Histogram pichia fda

15. CFDA • Saccharomyces, Pichia • vitální vzorek - nízká fluorescence • fixované buňky - vysoká fluorescence • Thermus • vitální vzorek - jasná fluorescence • fixované buňky - téměř bez fluorescence

16. FDA – esterázová aktivita

17. DNA – buněčný cyklus, FITC • FITC • interakce s neprotonovanými alifatickými amino-skupinami → s N-koncem polypeptidu a ε-aminoskupinou lysinu • Srovnání s biuretovým spektrofotometrickým stanovením

18. Statistické vyhodnocení - opakovatelnost

19. Děkuji za pozornost