公共化学实验教学中心

1. 公共化学实验教学中心 NORTHWEST UNIVERSITY 金属β-内酰胺酶L1的表达、纯化及催化青霉素水解的动力学表征 《化学生物学》实验课程组 杨科武

2. 实验技能训练要点 主要新知识 • 基因工程操作技术：质粒转移、耐药菌筛选； • 工程菌细胞培养技术：一级种子、基因诱导表达； • 重组蛋白分离纯化技术：细胞收集 、破碎；蛋白收集； • 蛋白质、酶理化性能分析：分子量确定、酶活性评价； • 酶催化抗生素水解的动力学表征。

3. 实验技能训练要点 主要知识回顾 • 仪器分析：色谱技术 –快速蛋白质纯化仪 光谱技术-紫外分光光度计、荧光光谱…… • 化学生物学导论：蛋白质、酶…… • 蛋白质与酶化学：重组DNA技术…… • 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、电泳、质谱….. LOGO

4. 背景知识 关键词：抗生素耐药、金属β-内酰胺酶 Antibiotics Resistance to Drug 、metallo-β-lactamase • 在医院中滥用抗生素：医生对抗生素应用认识不足 • 在家庭中滥用抗生素 ：随意应用和不规律应用抗生素 • 农业中滥用抗生素：动物饲料 • 其它：杀菌剂在清洁剂中开始使用…… LOGO

5. 世界难题！！！

6. 临床上过量的使用ß-内酰胺类抗生素，导致人体产生一类耐药性细菌，这类细菌中含有一类特异性酶，称之为β-内酰胺酶。临床上过量的使用ß-内酰胺类抗生素，导致人体产生一类耐药性细菌，这类细菌中含有一类特异性酶，称之为β-内酰胺酶。 β-内酰胺酶分为A、B、C、D四大类。A，C和D类为丝氨酸-β-内酰胺酶，它们在其活性中心需要一个丝氨酸残基来推动ß-内酰胺环的开环。 B类酶为金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamases，MBLs），其活性的发挥通常依靠锌离子。 β-Lactamases β-内酰胺酶

7. Scheme 1. Hydrolysis reaction of antibiotics catalyzed by MBL L1.

8. Table 1 Classification of MBLs.

9. 实验内容提要 1.实验目的 2.实验原理 3.实验仪器与试剂 4.实验步骤与方法 5.实验结果与讨论 6.实验延伸 思考题 参考文献

10. 了解金属酶表达的原理和意义； 掌握金属酶在原核细胞BL21中的表达和纯化的过程和实验技术； 掌握金属酶理化性能分析、活性测定的原理和方法； 掌握酶催化反应动力学常数的测定方法； 熟练掌握动力学数据处理的各种方法。 1.实验目的 通过探索和认识金属β-内酰胺酶的性质、结构和构象，基于表征所获其活性中心的信息，设计、合成细菌耐药靶酶的抑制剂。

11. Figure 1. Principles of operation for chromatography techniques 2、实验原理—液相色谱法 凝胶色谱 疏水色谱 离子交换 亲和色谱 反相液相色谱

12. 2、实验原理-SDS-PAGE Mr为蛋白质的分子量； K为常数； b为斜率； mR为相对迁移率。 mR =样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）

13. 底物浓度很低时 ： 底物的浓度增加到一定的程度后 ： 当底物浓度足够大时 ： 2、实验原理--动力学常数测定 米氏方程

14. 试剂 质粒pET26b(+) L1，感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，琼脂粉，过硫酸胺，甘油，溴酚蓝，甘氨酸，考马斯亮蓝，二硫苏糖醇，四甲基乙二胺，三羟甲基氨基甲烷，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，异丙基-β-D-硫代半乳糖，胰蛋白胨，酵母粉，硫酸锌，预染蛋白 Marker，青霉素G，二甲砷酸钠。 3.实验仪器和试剂 注意：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺有毒，带手套操作

15. 3.实验仪器和试剂 仪器 恒温摇床 超净台 高压灭菌锅 纯水仪 快速蛋白质纯化仪 离心机 超声波破碎仪 电泳脱色仪 电泳装置 西北大学化学与材料科学学院

16. 4.实验步骤和方法 --L1的表达和纯化

17. 4.实验步骤和方法--L1的表达和纯化 环节1 环节2 环节3

18. 系统准备 装柱 自动配制缓冲液（离子交换使用） 平衡 上样 上样&清洗 4.实验步骤和方法--FPLC纯化蛋白

19. 3.实验步骤和方法--FPLC纯化蛋白 收集方式：Fixed volume+ Peak Frac. 命令： 开始：Fracnation_900 Peak_Frac_900 PeakfracparametersUV 结束：Fracnation_900_stop Peak_Frac_900_stop If Fracnation_900=2 mL Peak_Frac_900=2 mL 收集方式：Peak Frac. 命令： 开始：Peak_Frac_900PeakfracparametersUV 结束：Peak_Frac_900_stop If Peak_Frac_900=2 mL 收集方式：Fixed Volume 命令： 开始：Fracnation_900 结束：Fracnation_900_stop If Fracnation_900=2mL

20. 体系：酶（L1）、底物（青霉素G） 、缓冲液（50 mM pH为7的二甲砷酸钠溶液，100μM ZnSO4） 最佳波长测定：在上述设定条件下，取940μL 二甲砷酸钠溶液、50μL青霉素G和10μL蛋白L1进行全波长扫描，找出青霉素G的波长变化最大处，此即为最佳波长。 参数：Walvelength: 235nm； Run time: 60s; Cycle time: 1s； Type: initial rate； Calculation time range from: 0～60s。 4.实验步骤和方法--动力学常数测定

21. 4.实验步骤和方法--动力学常数测定 • 方法：以二甲砷酸钠溶液和青霉素G溶液作为背景进行扫描；加入L1进行全波长扫描，每组重复3次求平均值。每一组按下表所示的溶液量加入测量，共测量7组： 运用Origin软件拟合得Vmax、Km！

22. 细菌细胞密度（O.D.600）：测量时，用未加菌液的培养液作为空白液，样品不能离心，保持细菌悬浮状态，进行定量测试。细菌细胞密度（O.D.600）：测量时，用未加菌液的培养液作为空白液，样品不能离心，保持细菌悬浮状态，进行定量测试。 化学诱导剂的使用：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）不能高温灭菌，O.D.值到0.6 时加入，此时菌体生长到对数生长末期，菌体生长状态最好，IPTG有毒性，过早加入会严重影响菌体生长，如果在开始摇菌时就加入IPTG，会打乱整个菌体的生长，得不到所要的表达蛋白。 4.实验步骤和方法—注意事项

23. SDS-PAGE电泳：聚丙烯酰胺的作用是为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠是阳离子去污剂，有去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用和去多肽折叠等作用。SDS-PAGE电泳：聚丙烯酰胺的作用是为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠是阳离子去污剂，有去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用和去多肽折叠等作用。 酶促反应动力学常数测定：温度、pH值、底物浓度和产物等会对实验有一定影响。 感受态的制备：当把含有L1基因的质粒pET26b植入感受态 BL21(DE3)pLysS E.Coli 细菌中时，水浴90 s时，切记不可摇荡，要使其保持静止。 4.实验步骤和方法—注意事项

24. 1、查阅相关文献，设计B1类金属β-内酰胺酶CcrA的表达、 纯化过程，并进行实验。 2、现在临床上各种抗生素对不能抑制或破坏金属β-内酰胺酶L1的活 性，细菌耐药的问题仍然困扰着我们。请查阅文献，解决一下问题： （1）FDA批准的抑制剂卡拉维酸等是否能抑制L1的活性？ （2）现在，报道过的抑制剂有哪些，试总结。 3、如何进行酶抑制剂的抑制动力学实验？实验数据如何处理？ 请查阅 相关参考书、文献进行设计，并进行实验。 4、Kcat 在反应动力学中的意义是什么，如何求得？利用本实验的已知数据计算MβL-L1催化青霉素水解反应的Kcat值 6、实验延伸

25. Frere J-M, Galleni M, Bush K, et al. Is it necessary to change the classification of beta-lactamases? J Antimicrob Chemother. 2005, 55: 1051-3. Bush K, Jacoby G A. Updated functional classification of beta-lactamases . Antimicrob Agents Chemother. 2010, 54: 969-76. Fisher J F, Meroueh S O, Mobashery S. Bacterial resistance to beta-lactam antibiotics: compelling opportunism, compelling opportunity. Chem Rev. 2005, 105: 395-424. Garau G, Garcia-Saez I, Bebrone C, et al. Update of the standard numbering scheme for class B beta-lactamases. Antimicrob AgentsChemother. 2004, 48: 2347-9. Galleni M, Lamotte-Brasseur J, Rossolini G M, et al. Standard numbering scheme for class B beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: 660-3. Kumarasamy K K, Toleman M A, Walsh T R, et al. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. The Lancet Infectious Diseases. 2010, 10: 597-602. 参考文献

26. 7) Crowder M W, Walsh T R, Banovic L, et al. Overexpression, purification, and characterization of the cloned metallo-beta-lactamase L1 from Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob Agents Chemother. 1998, 42: 921-6. 8) Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, et al. 金由辛，包慧中，赵丽云等译．精编分子生物学实验指南(第5版)．北京：科学出版社，2008年． 9) Samuelsen, O., Castanheira, M., Walsh, T., and Spencer, J. Kinetic Characterization of VIM-7, A Divergent Member of the VIM Metallo-beta-Lactamase-Family, Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52: 2905-2908. 参考文献

27. 杨科武教授 研究方向： Chemical Biology, Metalloenzyme & Antibiotic Resistance, ProteinChip, Biopharmaceuticals • RESEARCH INTERESTS 1. Diagnoses of the Antibiotic Resistant Bacteria 2. Antibiotic Resistance in Bacteria---D-ala-D-alaipeptidase VanX 3. Inhibition Studies on Glyoxalase-II Isozymes from A.thaliana 4. Protein Chip and Small Molecule Chip

28. Thank You!

29. 请预习下一个实验 实验三 多维色谱与MALDI-TOF MS联用技术 对人血清中低丰度蛋白的分离与鉴定 《化学生物学》实验课程组 白 泉