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流感病毒的鉴定

流感病毒的鉴定. 福建省卫生防疫站 杨式芹. 一、原理. 流感病毒粒表面的血凝素（ HA） 蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构。流感病毒的受体为含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，许多哺乳类动物和禽的红细胞表面均有此两种成分，因此，它们均能被流感病毒所识别和结合，并发生红细胞凝集现象。 于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒 HA 蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制试验。. 流感病毒虽然能凝集多种哺乳类和禽类的红细胞，但应用最广泛的为 豚鼠、鸡和人“ O” 型的红细胞。. 二、红细胞凝集试验及其抑制试验.

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流感病毒的鉴定

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Presentation Transcript

  1. 流感病毒的鉴定 福建省卫生防疫站 杨式芹

  2. 一、原理 • 流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构。流感病毒的受体为含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，许多哺乳类动物和禽的红细胞表面均有此两种成分，因此，它们均能被流感病毒所识别和结合，并发生红细胞凝集现象。 • 于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制试验。

  3. 流感病毒虽然能凝集多种哺乳类和禽类的红细胞，但应用最广泛的为 豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。

  4. 二、红细胞凝集试验及其抑制试验 • 红细胞凝集及其抑制试验按其容量多寡分为两大类： 1）常量法：总容量为0.75ml 2）微量法：总容量为常量法的1/10 • 国内把红细胞凝集抑制（HI）测定分为三种： 1）常规法 2）半加敏法 3）加敏法

  5. 1.材料： • 标准参照血清即国家流感中心最新公布的甲3（H3N2），甲1（H1N1）和乙型 病毒的免疫血清。 • 标准参照抗原即国家流感中心最新公布的H3N2，H1N1和乙型的病毒抗原。 • 质量可靠的受体破坏酶（RDE）。 • 配制好的1%鸡或豚鼠或人的红细胞。 • 0.85% NaCl。 • 干净的大孔塑料板。 • 10 ml和1 ml吸管或稀释器。 • 试管、三角瓶、试管架，笔。 • 消毒缸、冰盘、37℃和56℃水浴箱。 • 待鉴定病毒。

  6. 2.操作步骤 • 1）RDE处理标准参照血清 • 2）四个单位抗原的配制 • 3）红细胞凝集滴度计算（见表1） • 4) 四个血凝单位复核测定 • 5）红细胞凝集抑制测定（见表2）

  7. 6）观察结果： • 一层红细胞均匀地铺于孔壁上者为++++。 • 基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。 • 红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。 • 红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。 • 如用鸡红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪样为-。 • 如用豚鼠或人红细胞形成一个小圆圈，边缘光滑无任何小凝集者为-。 • “±”即为可疑，计算时以“-”（阴性）处理。

  8. 计算时请参考以下口诀： ① 先整后算。表1中，1-4，6和7不必进行整理，而5中，必须将1:640处一个加号挪到1:320处，使1:320处为4个加号，而1:640处变成两个加号，然后再进行计算。 ② 两个加号不用算。如表1中3，其滴度为640。 ③ 小，小本身的1/8。如表1中2，1:640处仅一个加号，故其血凝滴度一定少于640，计算之：640-640/8=560。 ④ 大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，计算之：640+640/4=800。 ⑤ 两个极端取中间（均数）。如表1中1，1:320时4个加号，而1:640时阴性，计算之：320+640/2=480。

  9. 表中6结果表明，血凝滴度未抓住，它必然大于1280，也可能成≥1920。因1:1280的高一个稀释度为1:2560，1:2560时可能出现的结果应从“–”至“++++”，当“–”时，滴度为1920，其余情况下均大于1920。当然要想知道精确的滴度应重新滴定，直至终点抓住为止。7中是否有血凝滴度？不清楚，其血凝滴度肯定<10，同理1:5处可能出现–～++++。当出现++++时，血凝滴度应为7.5，其余情况下均小于7.5。表中6结果表明，血凝滴度未抓住，它必然大于1280，也可能成≥1920。因1:1280的高一个稀释度为1:2560，1:2560时可能出现的结果应从“–”至“++++”，当“–”时，滴度为1920，其余情况下均大于1920。当然要想知道精确的滴度应重新滴定，直至终点抓住为止。7中是否有血凝滴度？不清楚，其血凝滴度肯定<10，同理1:5处可能出现–～++++。当出现++++时，血凝滴度应为7.5，其余情况下均小于7.5。

  10. 四个血凝单位计算：将血凝单位除以4，表1中1它的四个血凝单位应为：480/4=120，即将标本1进行1:120稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。请注意！1:120稀释应为1ml病毒悬液加119ml稀释液（一般为生理盐水）。

  11. 同样计算之前，有些结果必须进行整理，如6中，必须把1︰320处一个加号挪到1︰640处，使1︰320处变成“–”，而1︰640处变成“++++”，然后再进行计算。同样计算之前，有些结果必须进行整理，如6中，必须把1︰320处一个加号挪到1︰640处，使1︰320处变成“–”，而1︰640处变成“++++”，然后再进行计算。 • X=Y+Y/4·Z • X为需求的血清效价，Y为能引起血凝全部抑制最高血清稀释度的倒数，Z为4减掉不能被抑制数（指全抑制高一个稀释度处）。

  12. 鉴定结果判断： • （1）标准参照血清对分离的抑制效价达≥ 20才可算为阳性。 • （2）一个分离物不能被两种或以上标准参照血清同时有≥ 20的抑制。 • （3）一个分离物被H3N2免疫血清有≥ 20抑制，而H1N1和乙型免疫血清抑制效价均<20。可认为分离物H3亚型病毒，同理仅被H1N1免疫血清有≥ 20或仅被乙型免疫血清有≥ 20抑制，可认为分离物为H1亚型病毒或乙型病毒。 • （4）三种标准参照血清对分离的抑制物效价均<20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。

  13. 交叉血凝抑制测定和抗原比计算 • 由于流感病毒的抗原性能经常不断地发生变异，变异程度与疾病发生与流行强度常成正相关。 • 交叉血凝抑制测定和抗原比计算仍为最简便、可靠和敏捷地了解流感病毒抗原性是否已发生变异，其变异幅度有多大的一种手段。

  14. 三、流感实验室检测中应注意的若干问题 • 1. 禁止在同一实验室和同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。 • 2.禁止在同一实验室，同一时间处理接种采至不同动物的标本。动物的标本必须与人的标本分别保存。 • 3.接种后剩余原始标本,有条件的应置-70 ℃或以下保存，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。

  15. 4.严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。4.严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。 • 5.向国家流感中心送毒株时，量至少需5ml，同时需自己保存一些，以便寄送过程发生意外可继续补送。 • 6.流感病毒在-20 ℃ ~-40 ℃ 时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。 • 7.鸡胚中分离的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。

  16. 8.讲科学，严防弄虚作假，寄送毒株时一定需附上送检表，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心。8.讲科学，严防弄虚作假，寄送毒株时一定需附上送检表，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心。 • 9.病毒检查需不间断地进行，要注意从散在病例中分离流感病毒。 • 10.每个检测点需重视从儿童中分离流感病毒，重视家禽、畜中流感动态。 • 11.病毒分离也可采用细胞管，但每份标本需接钟3-4管。 • 12.病毒的初步鉴定也可用半加敏微量法。

  17. 谢 谢 大 家 ！

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