Eksperimenta metodes bioloģijā

1. Eksperimenta metodes bioloģijā 2-4. lekcija 2014./2015. mācību gada 1. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Dažādas* - mikas. • Geno-mika • Transkripto-mika • Proteo-mika LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Dažādas* - mikas. Izmanto dārgas un sarežģītas tehnoloģijas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Dažādas* - mikas. • Geno-mika • Transkripto-mika • Proteo-mika LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Genomika pēta organisma genomu (genomu kopumā, molekulārā līmenī) Mūsdienu izpratnē - veicot visa genoma nukleotīdu secības noteikšanu - DNS (RNS) sekvenēšanu (hromosomālā DNS, plazmīdas, šūnu organellu genomi) un - gūtās informācijas bioinformātisku apstrādi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. DNS sekvenēšana - ķīmiskā sekvenēšana (Allan Maxam, Walter Gilbert),1977; DNS fragments tiek noārdīts 4 dažādos apstākļos (reakcijās), kā rezultātā pārrāvumi veidojas attiecīgi pie nukleotīdiem: G; A+G; C vai C+T. Patreiz metode tiek izmantota visai reti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. DNS sekvenēšana - enzimātiskā (Sangera; pavediena terminācijas metode)(Frederick Sanger),1977; Tiek veiktas 4 enzimātiski katalizētas in vitro DNS sintēzes reakcijas. Katrai no tām pievieno noteikta veida sintēzi terminējošos didezoksinukleozīdu trifosfātus: ddATP; ddCTP; ddGTP vai ddTTP. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. DNS sekvenēšana Abās metodēs iegūto DNS fragmentu izmēritiek analizēti: - ar augstas izšķirtspējas denaturējošās elektroforēzes palīdzību poli-akrilamīda gelos (vienā sekvenēšanas paņēmienā var nolasīt līdz 200 - 300 nukleotīdu); - enzimātiskajai metodei attīstoties, ar kapilārās elektroforēzes palīdzību (vienā sekvenēšanas paņēmienā var nolasīt līdz 600 [1000] nukleotīdu). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. DNS sekvenēšana Galvenais ierobežojošais faktors ir elektroforēze, kurā liela izmēra (virs 700 nt) DNS fragmentu molekulmasas (garuma) izšķiršana ar 1 nukleotīda precizitāti ir problemātiska - lielielāku DNS fragmentu zonas sāk saplūst, ir grūti pamanīt atšķirību starp DNS fragmentiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. DNS sekvenēšana Produktu vizualizēšana Abās metodēssākotnēji izmantoja 5' gala radioaktīvo iezīmi un gelu eksponēšanu uz rentgenfilmas. Enzimātiskajai metodei attīstoties, kad tās veikšanā sāka izmantot PCR principus, varēja iegūt lielāku jaunsintezēto DNS fragmentu apjomu, ko pēc pAA gelelektroforēzes varēja ieraudzīt arī gelus krāsojot ar metodēm, kurās izmanto sudraba sāļus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. DNS sekvenēšana Produktu vizualizēšana Enzimātiskajai metodei attīstoties tālāk, sāka izmantot fluorescenti iezīmētus ddNTP (Dye-terminator sequencing). Katram no tiem (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) sāka piesaistīt citas krāsas fluorescento iezīmi, kas ļāva visas 4 reakcijas veikt vienā stobriņā un produktus analizēt ar kapilārās elektroforēzes palīdzību. Process kļuva daļēji automatizējams. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. DNS sekvenēšana Procesa automatizācija Jaudīgie automātiskie sekvenatori vienā darba ciklā ļauj analizēt: - līdz 384 paraugus (paralēli), - diennaktī pagūstot veikt līdz 24 darba cikliem, nolasot ap 6,5 Mb DNS diennaktī. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Genomika Paliek problēma - - genomi lieli (105 - 1010 bp), - vienā sekvenēšanas reizē var nolasīt tikai 600 (1000) nukleotīdu. Tātad, sekvenējamais materiāls jāsadala salīdzinoši nelielos posmos. Piemēram, E. coli genoms 4x106 bp būtu sadalāms vismaz: 4x106 / 600 =~ 7 000 posmos (fragmentos). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Genoma bibliotēkas Klasiskajā risinājumā - (Clone-by-clone sequencing) lielā genoma sadalīšanai fragmentos izmanto gēnu inženierijas metodes, veidojot labi raksturotasgenoma bibliotēkas. Lai veiksmīgāk pareizā secībā sakārtotu bibliotēkās pārstāvētos genoma fragmentus, vēlams lai pirms tam būtu raksturoti: - unikāli genoma marķieri kā arī - noteikta to secība genomā, piederība noteiktām hromosomām un atrašanās vieta hromosomā (lokuss). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Bibliotēkas kārtošana Ar unikālo marķieru palīdzību identificē klonēto DNS fragmentu izcelsmi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Genoma marķieri Unikāli genoma marķieri - EST (expressed sequence tag) - īsa, unikāla, kādam noteiktam gēnam raksturīga DNS sekvence, kura iegūta no mRNS (cDNS), un noderīga šī gēna lokusa atrašanai genomā vai genoma bibliotēkās. NCBI nukleotīdu sekvenču datu bāzes (GenBank) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ EST sekvenču sadaļā atrodami 73,4 miljoni EST sekvenču no ~ 2 500 sugu organismiem. Pārstāvētākie organismi ir: Homo sapiens- 8 692 773 sekvences, Mus musculus- 4 853 570 sekvences, Zea mays- 2 019 137 sekvences LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Genoma marķieri Unikāli genoma marķieri - STS (Sequence-tagged site) - īsa, abos galos unikāla DNS sekvence, kuru ērti meklēt ar PCR palīdzību, un, kuras lokusa atrašanās vieta genomā ir zināma. Daudzi STS marķieri sevī ietver mikrosatelītu sekvences. unikāla sekvence PCR praimeru saistīšanās vietas LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Genoma marķieri Mikrosatelīti - ģenētiskie elementi, atkārtoto sekvenču grupas pārstāvji, kurus veido daudzkārtēji īsu sekvenču (2-6 bp) atkārtojumi. Piemēram, (AC)n, (ACTC)n utt., kur n ir atkārtojumu skaits, un tas variē no 3 līdz ~ 100. . Lielāka interese ir par mikrosatelītiem, kuros n > 10, jo tiem raksturīga salīdzinoši liela mainība (starp haplotipiem atkārtojumu skaits mikrosatelītā variē). Līdz ar to šādam mikrosatelīta lokusam populācijā vērojama izteikta alēliskā daudzveidība. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Genoma marķieri Mikrosatelītu apzīmēšanai plaši tiek lietoti vairāki saīsinājumi, kuri vairāk vai mazāk uzskatami par sinonīmiem: SSR - simple sequence repeats, STR - short tandem repeats, VNTR - variable number tandem repeats, taču tas ir plašākas atkārtojumu elementu grupas apzīmējums, kurā ietilpst ne tikai mikrosatelīti bet arī nedaudz garākie minisatelīti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Genoma marķieri Ģenētiķu interesi mikrosatelīti piesaista ar savu alēlisko daudzveidību, kas ļauj: - izvērtēt to savstarpēji saistītu (atrodas uz vienas hromosomas) vai nesaistītu (atrodas uz dažādām hromosomām)iedzimšanu, - pētot to pārmantošanu plašu ģimeņu paaudzēs aprēķināt ģenētisko distanci (morganīdās) starp saistīti iedzimstošiem mikrosatelītiem - veikt hromosomu ģenētisko kartēšanu, - raksturot un salīdzināt populācijas, LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. Genoma marķieri Ģenētiķu interesi mikrosatelīti piesaista ar savu alēlisko daudzveidību, kas ļauj: - meklēt mikrosatelītus (to alēles), kuri iedzimst kopā ar kādu no iedzimtajām slimībām, kas norāda, ka slimībā iesaistītais (-ie) gēns (-i) atrodas netālu no šiem mikrosatelītiem, - tos izmantot kā marķierus konkrēta indivīda identificēšani (kriminalistikas ekspertīzes) u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. GCTTCCAATTCAATTCATCCTAACCAAAG---(AC)n---TTAGAAAAATTTCCACCACATTTCTATCCGCTTCCAATTCAATTCATCCTAACCAAAG---(AC)n---TTAGAAAAATTTCCACCACATTTCTATCC CCAATTCAATTCATCCTAA AAGGTGGTGTAAAGATAG Genoma marķieri Mikrosatelītus saturošo STS raksturošanas metodes: 1. DNS bibliotēku skrīningam - PCR, - iznākuma pārbaude - jā/nē testa formā (parasti ar elektroforēzi agarozes gelā); LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Genoma marķieri Mikrosatelītus saturošo STS raksturošanas metodes: 2. Alēlisko variantu noteikšanai - PCR, - tās produktu analīze ar augstas izšķirtspējas denaturējošās elektroforēzes palīdzību poli-akrilamīda gelos (līdzīgi kā pēc sekvenēšanas reakcijas, jo rezultāts jāiegūst ar nukleotīda precizitāti) vai - ar kapilārās elektroforēzes palīdzību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. Genoma marķieri Paraugi 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Mikrosatelītus saturošo STS raksturošanas metodes piemērs: PCR produktu analīze ar augstas izšķirtspējas denaturējošās pAAG elektroforēzes palīdzību un DNS krāsošana ar sudraba nitrātu. *9 *8 *7 Aleles *6 *5 *4 *3 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. DNS pavedienu masa Piemēram, (AC)n mikrosatelīta gadījumā: dp DNS: ACACACACACACAC... TGTGTGTGTGTGTG... Mw vidējos apēķinos 650 Da/bp Nukleotīdi: A - 313.2 Da T - 304.2 Da C - 289.2 Da G - 329.2 Da [AC] = 602.4 Da [TG] = 633.4 Da [(AC)20] = 12 048 Da [(TG)20] = 12 668 Da D = 620 Da LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. Genoma marķieri Mikrosatelītus saturošo STS raksturošanas metodes piemērs: Fluorescenti iezīmētu PCR produktu analīze ar kapilārās elektroforēzes palīdzību. Signāla intensitāte bp LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. Genoma marķieri Piemērs: kāda mikrosatelītu saturoša STS alēļu biežums divās dažādās populācijās. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. Genoma marķieri Viena no plašākajām cilvēka gēnu kartēm 99-GB4 (GeneMap99-GB4)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&MAPS=gb4 sevī ietver 104 388 STS marķierus. Genomisko bibliotēku raksturošanai un kārtošanai tiek izmantoti arī vēl citu veidu marķieri. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. Genoma marķieri Unikālo marķieru izvietojuma raksturošanas metodes: - ģenētiskā kartēšana nosakot marķieru iedzimšanas veidu (saistīti/nesaistīti, saistīto marķieru attālums morganīdās), - FISH (fluorescence in situ hybridization), - pulsējošā lauka elektroforēze un DNS hibridizēšana, - hibridizēšana vai PCR ar noteiktas hromosomas DNS vai apjomīgu delēciju saīsinātās hromosomās, - radiācijas hibrīdu kartēšanu u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. Genoma bibliotēkas Iesākumā parasti izmanto GI vektorus, kuri piemēroti lielu DNS fragmentu ievietošanai (baktēriju vīrusu vektori, mākslīgās hromosomas /inserti 0,1 - 1,0 Mb/ ). Piemēram, ja vidējais DNS insertu garums 0,1 Mb (105 bp) - E. coli genoms (4x106 bp) iekļautos 4x106 / 105 = 40 bibliotēkas klonos; - diploidāls cilvēka genoms (6x109 bp) iekļautos 6x109 / 105 = 60 000 bibliotēkas klonos. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Bibliotēkas kārtošana Ar unikālo marķieru palīdzību identificē klonēto DNS fragmentu izcelsmi un lietderīgumu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. DNS subklonēšana Tālāk veic klonēto genoma fragmentu papildus izpēti: - kartēšana ar restrikcijas enzīmu palīdzību, - vajadzības gadījumā meklē papildus marķierus un - plāno subklonēšanas eksperimentus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. DNS subklonēšana DNS subklonēšanas rezultātā lielie DNS inserti ar gēnu inženierijas metodēm tiek sadalīti īsākos fragmentos un ievietoti subklonēšanas vektoros. Sekvenēšanai izmanto universālus praimerus, kuri komplemetāri vektora sekvencēm inserta abos galos. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. Genomika Attīstoties: - sekvenēšanas jaudām, - bioinformātiskajiem rīkiem un - samazinoties sekvenēšanas izmaksām sāka atteikties no: - marķieru meklēšanas un raksturošanas, - DNS klonu atlases un kārtošanas kā arī - DNS subklonēšanas. => "shotgun sequencing" LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Genomika "shotgun sequencing" 1. DNS enzimātiska vai mehāniska fragmentēšana +/- sekvenējama garuma vai 2 - 4 (20) reizes lielāka garuma, gadījuma fragmentos. 2. Fragmentu ievietošana DNS klonēšanas vektoros. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. Genomika "shotgun sequencing" Šajā gadījumā genomiskā bibliotēka veidojama izteikti apjomīgāka, lai bibliotēkā ietvertie DNS inserti daudzkārt pārklātu genoma apjomu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. Genomika "shotgun sequencing" 3. Visu klonu insertu pilnīga sekvenēšana; inserta viena vai abu galu "nolasāmā posma" sekvenēšana. 4. Iegūto sekvenču elektroniska kārtošana un apvienošana. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. 500 nt 9000 nt 500 nt 500 nt 1000 nt 500 nt Genomika "shotgun sequencing" Pēdējā laikā lielāko piekrišanu guvis "hierarchical shotgun" risinājums. 1. Tiek veidota 10 kb insertu bibliotēka un katra inserta abi gali tiek sekvenēti (~ 500 + 500 nt). 2. Tiek veidota 2 kb insertu bibliotēka un katra inserta abi gali tiek sekvenēti (~ 500 + 500 nt). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Genomika "shotgun sequencing" Pēdējā laikā lielāko piekrišanu guvis "hierarchical shotgun" risinājums. Sekvenēšanai izmanto universālus praimerus, kuri komplemetāri vektora sekvencēm inserta abos galos. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. Genomika Šajā risinājumā zināmie attālumi starp nolasītajām sekvencēm ļauj labāk izsekot vai sekvenču apvienošana norit pareizi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. Genomika Šajā risinājumā zināmie attālumi starp nolasītajām sekvencēm ļauj labāk izsekot vai sekvenču apvienošana norit pareizi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. ? 1 000 - 7 000 nt Genomika Nereti gadās, ka "shotgun" risinājums neļauj pilnībā rekonstruēt visu genomu. Tad tiek iesaistītas papildus metodes. Ja ir pamats domāt, ka iztrūkst neliels (dažas kb) sekvences posms - papildus izmanto "primer walking". LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. Genomika "primer walking"(nejaukt ar "chromosome walking") 1. Abās pusēs nenoskaidrotajam posmam - izveido praimeru pāri, - veic PCR, (iegūto produktu var arī klonēt vektorā), - veic PCR produkta abu galu sekvenēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. Genomika "primer walking" 2. Vadoties no iegūtajām sekvencēm: - izveido jaunu praimeru pāri, - veic PCR, - veic PCR produkta abu galu sekvenēšanu utt. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. Genomika Nereti gadās, ka "shotgun" risinājums neļauj pilnībā rekonstruēt visu genomu. Ja iztrūkst liels (vairāk nekā 7 kb) sekvences posms: - nākas veidot lielus DNS fragmentus saturošu genoma bibliotēku un, - izmantojot zināmo galu sekvences, tajā meklēt iztrūkstošā posma sekvenci saturošos DNS klonus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. ? Genomika Meklēšanai izmanto: - PCR vai - hibridizēšanu ar specifiskām DNS zondēm. Atlasa meklēto sekvenci saturošos genomiskās bibliotēkas klonus; ar subklonēšanas palīdzību veic tajos insertētās DNS sadalīšanu īsākos fragmentos; sekvenē subklonos ievietotos DNS fragmentus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. Genomika Genoma sekvence iegūta. Ko darīt tālāk? LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48. Genomika Iegūto genoma sekvenci analizē ar bioinformātikas metožu (specializētu datorprogrammu) palīdzību. Identificē: a) potenciālos gēnus - - meklējot pietiekami garus ORF(open reading frame), - identificējot jau aprakstītu (sekvenētu) mRNS (cDNS) atrašanos, novietojumu kopējā genoma sekvencē, LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49. Genomika Identificē: a) potenciālos gēnus - meklējot iespējamo promoteru sekvenču izvietojumu kopējā genoma sekvencē, - izmantojot DNS sekvenču homoloģiju (līdzību) ar jau aprakstītiem / izpētītiem gēniem un genomiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

50. Genomika Identificē arī citus genoma struktūras elementus: b) ORI(origin of replication)- specifiska sekvence, no kuras sākas DNS replikācija; c) telomēru sekvences; d) centromēru sekvences; e) atkārtoto sekvenču rajonus (piemēram, mikrosatelītu , minisatelītu, insercijas elementu sekvences) u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML