木鳖子提取物通过调节 MAPKs 通路诱导黑色素瘤 B16 细胞分化的实验研究

木鳖子提取物通过调节MAPKs通路 诱导黑色素瘤B16细胞分化的实验研究河北医科大学第四医院科研中心/肿瘤研究所赵连梅

研究背景（一） 肿瘤的分化治疗 • 目前认为，肿瘤的形成同细胞分化异常有关，即肿瘤细胞不能进行正常分化，或是分化能力降低，从而导致肿瘤克隆的形成。进一步的研究发现，肿瘤细胞有可能在适当的刺激下被诱导分化，使之向正常细胞转变。 • 在特定药物作用下，恶性肿瘤细胞向正常细胞演变分化，表现为形态学、生物学和生物化学诸标志物方面向正常细胞接近，甚或转变为正常细胞，这种现象即称为肿瘤的诱导分化（differenation）或再分化、肿瘤逆转。这些能够诱导肿瘤细胞逆转的化学物质称为分化诱导剂。 • “诱导分化”概念的提出，为肿瘤治疗提供了一个新的治疗途径。它是针对肿瘤细胞特异性杀伤，而不损伤正常人体组织细胞的药物，也是肿瘤治疗方面一个较好的，具有潜力的方向。

黑色素瘤（melanoma） 研究背景（二） Differentiation inducer Early invasion and metastasis Median survival :6-9month Normal chemotherapy protocol Treatment-resistant Information is limited new drugs or novel therapy

黑色素瘤细胞是研究肿瘤细胞分化的理想模型 • 黑色素瘤细胞向正常细胞分化后，出现典型的树突状突起结构，黑色素生成及酪氨酸酶活性增加。 • Add your title in here （图片来自文献） Dendrite-like outgrowth tyrosinase activity Melanin production find out the agent that induce melanoma cell differentiation from plants

中药木鳖子 • 本实验将探讨中药木鳖子提取物对黑色素瘤B16细胞的诱导分化作用及其相关机制主产：广西、四川、湖北。主治：消肿散结，祛毒。　　治痈肿、疔疮、痔疮、无名肿毒。多在治疗肿瘤的方剂中出现，但是文献中并未见木鳖子提取物抗肿瘤的研究报道。

木鳖子 活性成分阳性对照：α-MSH B16 cells 木鳖子实验路线和方法：细胞活性检测形态观察细胞功能活性成分提取乙醇浸泡7天,加热回流提取2次细胞增殖抑制和集落形成率 Giemsa染色/超微结构观察/荧光染色（AlexaFluor488 phalloidin) 黑色素\酪氨酸酶\ 细胞转移侵袭能力检测旋转蒸发仪冷冻浓缩成浸膏萃取 P38\ERK\JNK基因水平表达变化特异性通路抑制剂SB203580(P38）、PD98059(MEK)对药物诱导分化的影响 P38\ERK\JNK蛋白水平及活性（磷酸化水平）的变化乙酸乙酯 ( 石油醚 ) 正丁醇乙醚水相选择活性改变显著的通路 MTT法、形态学检测筛选出具有生物活性的液相大孔树脂筛选出活性单体化合物硅胶柱层析检测该通路下游基因及蛋白表达的变化 MAPKs通路上游PKA、PKC活性的变化

CMSEE对B16细胞增殖活性及克隆形成率的影响 Table 1 Inhibitory effect of CMSEE on melanoma B16 cells A 1 2 3 The cell viability and modality of B16 cells after treatment by CMSEE(×200). Morphological changes of B16 cells observed under the microscope. 1: untreated cell; 2: CMSEE (20mg/L); 3: CMSEE (100mg/L) Compare with Control, P<0.01, **P<0.001 B 1 3 4 Fig.1 Effect of CMSEE on the clone forming of B16 cells A: The representative picture of clone forming(×200). 1.Control；2.CMSEE (10mg/L)；3.CMSEE (20 mg/L);4.CMSEE(40mg/L) B: Clones counting.Compare with control group, *P<0.05,**P<0.01

x200 x200 x400 CMSEE对B16细胞形态的影响 Untreated cell CMSEE Treated cell Fig.2 Morphological changes of B16 cells after treated with CMSEE (20mg/L) for 48h. 细胞体积增大，细胞核大小均一，核浆比例减少，出现典型的树突状和网状结构，呈梭形排列

CMSEE作用于B16细胞的透射电镜形态变化 正常细胞核大，圆形，常染色质丰富，异染色质较少。未见黑色素小体。高倍镜下可见细胞质表面可见许多微绒毛，包膜完整，细胞质内细胞器少。 Control（× 4K） CMSE(20mg/L（× 4K）经过CMSEE处理后，细胞体积变大，细胞核缩小，异染色质增多，呈多边形，细胞表面微绒毛减少，核内异染色质增多，核质比减小，可见不同的黑色素小体，部分细胞大量黑色素小体聚集成团。 Control（× 20K） CMSE(20mg/L （× 20K） Fig.2 Morphological changes of B16 cells electron microscopeobserved by electron microscope after treated with CMSEE by (20mg/L) for 48h.

不同浓度CMSEE对B16细胞分化率的影响 A B C D Figure.3 Enhancing effect of CMSEE on B16 cell differentiation B16 cells were treated for 48h with CMSEE. The cells were assessed by morphologic analysis using Giemsa stain. The arrows indicate differentiated B16 cells with dendrite formation. A: untreated cell;. B, C, D: treated with CMSEE (10, 20, 40mg/L)

CMSEE对B16细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响CMSEE对B16细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响 Table.3 The effect of CMSEE on the production of melanochrome and the activity of tyrosinase 原理：碱裂解法和比色法 ** ** * ** ** ** * ** * ** * Compare with control group, *P<0.05, **P<0.01

CMSEE对B16细胞迁徙和转移的影响 划痕试验侵袭实验 Control 5-Fu CMSEE(20mg/L)

MAPK信号通路对肿瘤细胞分化的调节作用 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路是近年来信号转导方面最活跃的研究领域。研究表明,它们与肿瘤细胞的凋亡、分化、侵袭和转移等有着重要关系, 将为肿瘤的治疗提供新的靶点。 ERK是受外界刺激时决定细胞命运的关键性因素,它能促进增殖,决定细胞向终末期分化或发生凋亡。JNK和P38主要被应激刺激和病理性损伤信号所激活,介导细胞凋亡反应,但在某些细胞类型也被有丝分裂原激活,介导细胞分化与增殖。研究表明，MAPKS通路的活性参与了黑色素瘤细胞的分化调节

CMSEE对B16细胞MAPKs通路活性的影响 p-p38 Fig.4 The MAPKs activition (P38, JNK, ERK1/2) in CMSEE-induced B16 differentiation 20mg/L CMSEE能显著提高p-P38和p-JNK的表达水平(P<0.01)，在第2h时最明显。且能降低p-ERK1/2的蛋白表达水平，在第4h时最明显。表明CMSEE对黑色素瘤B16细胞的诱导分化作用与其提高P38通路和JNK通路和阻滞ERK1/2通路的活性相关。

PD98059对CMSEE诱导B16细胞分化的影响 (A) Control PD CMSEE CMSEE+PD CMSEE －—＋＋ PD －＋－＋ (B) p-ERK1/2 GAPDH 1 2 3 4 Fig.5 The effect of PD98059 on the CMSEE-induced differentiation of melanoma B16 cells. A: Differentiation morphology of B16 induced by different agents. B: the expression of p-ERK1/2 influenced by different agents 经40μM的ERK通路阻滞剂PD98059预处理1h后，20mg/L的CMSEE对B16细胞的分化作用明显增强，p-ERK1/2蛋白表达水平进一步降低，黑色素B16细胞树突状结构明显，证明了ERK1/2通路活性的降低促进了CMSEE对黑色素瘤细胞的诱导分化作用。

SB302580对CMSEE诱导B16细胞分化的影响 (A) Control SB 203580 CMSEE CMSEE+SB203580 CMSEE －－＋＋ SB －＋－＋ (B) p-p38 GAPDH Fig.6 The effect of SB302580 on the CMSEE-induced differentiation of melanoma B16 cells. A: Differentiation morphology of B16 induced by different agents. B: the expression of p-ERK1/2 influenced by different agents 经20μM的P38 MAP通路阻滞剂SB302580预处理B16细胞1h后加入20mg/L的CMSEE，B16细胞分化形态部分被阻滞，证明SB302580阻滞了CMSEE对p38通路的激活作用，证实CMSEE诱导B16细胞分化与P38 MAP通路活性降低相关

结论： 中药木鳖子醇提物能显著抑制恶性黑色素瘤B16细胞的增殖和集落形成能力，并呈时间和浓度依赖性。小鼠黑色素瘤B16细胞经较低浓度CMSEE作用后，细胞形态发生明显改变，细胞体积增大，细胞核大小均一，核浆比例减少，出现树突状和网状结构。B16细胞经CMSEE（10-40mg/L）作用后，黑色素合成能力和酪氨酸酶活性均明显增加，同时酪氨酸酶活性升高，且呈浓度依赖性，进一步证明了CMSEE对B16细胞的诱导分化作用。

CMSEE能显著提高P38和JNK通路的活性，降低ERK1/2通路的活性，且经ERK通路阻滞剂PD98059预处理后，CMSEE对B16细胞的分化作用明显增强, 证明了ERK1/2通路活性的降低促进了CMSEE对黑色素瘤细胞的诱导分化作用，而经P38 MAP通路阻滞剂SB302580预处理B16细胞后加入CMSEE，B16细胞分化形态部分被阻滞, 证实CMSEE诱导B16细胞分化与P38 MAP通路活性增强相关。因为我们暂未购买到JNK通路的阻滞剂，因此后继实验还有待于完成。更深入的分化诱导机制

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木鳖子提取物通过调节 MAPKs 通路诱导黑色素瘤 B16 细胞分化的实验研究