Modifide Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 in rice

การพัฒนาวิธีหา Aflatoxin B1 ในข้าวด้วยการใช้ Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Modifide Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 in rice

ผู้ร่วมจัดทำ น.ส. นัดติยา ประกอบแสง D4810056 น.ส. รัตนา เกียรติทรงชัย m4810131

วัตถุประสงค์ • เพื่อตรวจสอบและหาปริมาณของ alflatoxin B1 ในข้าว

การนำไปใช้ประโยชน์ • เพื่อตรวจหาระดับของ alflatoxin B1 ที่ปนเปื้อนอยู่ในข้าว นอกจากนั้นยังเชื่อมโยงไปถึงการปนเปื้อนในนาข้าวและพื้นที่ใกล้เคียง

หลักการ • ประยุกต์จากวิธีทดสอบของ Chu (1989) ในการทดลองของเราจะ coat แต่ละ well ของ microtiter plate ด้วย aflatoxin B1-oxime-BSA และ incubate ไว้ หลังจากล้างก็จะเติม ตัวอย่างข้าวที่ต้องการทดสอบหรือ aflatoxin B1 มาตรฐาน กับ anti-aflatoxin B1- BSA- HRP conjugate ลงไปพร้อมๆ กัน แล้ว incubate ต่อ สารพิษที่อยู่ในสารละลายข้าวหรือใน aflatoxin B1 มาตรฐาน จะแย่งจับกับ antigen ที่ติดอยู่กับผิวของ microtiter plate

และจะจับตรงบริเวณที่ antibody จะมาจับ หลังจากล้างอีกรอบ ก็จะตรวจสอบปริมาณของ antibody ที่จับอยู่บนผิวของ microtiter plate ได้โดย incubate กับสารละลาย substrate ผลของสีจากการทำปฏิกิริยาจะวัดโดยใช้เครื่อง spectrophotometer ปริมาณของ aflatoxin B1 ในตัวอย่างข้าวจะหาได้โดยการเทียบกับกราฟของ aflatoxin B1 มาตรฐาน

เชื้อราพวก Aspergillus flavus มักจะเจริญได้ในที่ที่มีความชื้นต่ำ เช่น ในเมล็ดธัญพืชทั้งถั่ว ข้าว เป็นต้น บทนำ • Aflatoxin : สารพิษสร้างจากเชื้อราพวก Aspergillus flavus สารพิษตัวนี้จะทำลายเซลล์ตับอย่างรุนแรง และยังเป็นสารก่อมะเร็งที่รุนแรงมากอีกด้วย

วิธีการเตรียมสารเคมี • ใช้สารเคมีระดับ AR grade • สารละลายสกัดตัวอย่าง (Sample extraction solvent ) • Carbonate coating buffer • Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 เข้มข้น 10 เท่า

PBS-Tween • Conjugate buffer • Substrate buffer • Enzyme Substrate

Aflatoxin B1-BSA เข้มข้น 500 เท่า • Anti-Aflatoxin (B1) Peroxidase conjugate • Blocking 1% • Colour stop reagent 0.5 N

รูปแสดง ข้าวกะเทาะเปลือก ขัดขาว บดละเอียด

วิธีทำการทดลอง • coat plate ด้วย Aflatoxin B1-BSA (sigma A6655) 100 ไมโครลิตร ต่อ well จะมีปริมาณ 2 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร • Incubate ใน moist chamber ที่ 4°C ข้ามคืน • ล้างด้วย PBS-T 3 ครั้ง • block ด้วย BSA 1% 200 ไมโครลิตรต่อ well ที่ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

ล้างด้วย PBS-T 3 ครั้ง • เติมสารละลายตัวอย่าง 50 ไมโครลิตรต่อ well แล้วตามด้วย Anti-AFB1- peroxidase conjugate 50 ไมโครลิตรต่อ well • Incubate ใน moist chamber ที่ 37°C 45 นาที • ล้างด้วย PBS-T 3 ครั้ง

เติม Enzyme Substrate 100 ไมโครลิตรต่อ well • Incubate ในที่มืด 10-15 นาที • หยุดปฏิกิริยาด้วย Colour stop reagent 25 ไมโครลิตรต่อ well • อ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 492 นาโนเมตร

ผลการทดลอง

ตารางที่ 1 แสดงค่าการดูดกลืนแสงของ standard aflatoxin B1

ตารางที่ 2 แสดงค่าการดูดแสงของตัวอย่างข้าวทั้ง 17 ตัวอย่าง

รูปที่ 2แสดงสีจากการทดสอบ standard aflatoxin ใน microtiter 96 well plate

สรุปผลการทดลอง • ไม่พบ aflatoxin ในปริมาณที่เกินกำหนด จากตัวอย่างข้าวทั้ง 17 ชนิด

เอกสารอ้างอิง • Anonymous. 1991. Aflatoxin analysis in groundnuts and groundnut products. Pages 195-278 in. The groundnut Aflatoxin problem: review and database (Mehan, V.K., Mcdonald, D., Haravu, L.J., and Jayanthi, S. eds.). Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. • Fan, T.S.L., and Chu, F.S. 1984. An indirect ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) for detection of aflatoxin B1 in corn and penut butter. Journal of Food Protection 47: 263-266

Chu, F.S. 1989. Current immunochemical methods for analysis of Aflatoxin in groundnuts and groundnut products. Pages 101-172. In Aflatoxin contamination of groundnuts : proceedings of the International workshop, 6-9 October 1987, ICRISAT Center, India. Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. • Wilson, D.M. 1989. Aflatoxin analytical methods for groundnut. Pages 191-199. Ibid • Anajaiah, V., Mehan, V.K., Jayanthi, S., Reddy, D.V.R. and Mcdonald, D. 1989. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for alflatoxin B1 estimation in groundnuts. Pages 1983-189. Ibid

FIN !! ไปต่อกันที่ WEB นะคะ

Modifide Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 in rice