Uso do Bacillus subtillis como probióticos, para controle de Vibrios em cultivos de camarões.

1. Uso do Bacillus subtillis como probióticos, para controle de Vibrios em cultivos de camarões. Engenharia Química. DILE P. STREMEL(1) JOSELAINE C. DE JESUS(2), PAULO JOSÉ PADILHA(3), JULIANA DE MEDEIROS(3) (1) Professor Orientador (2) Bolsista do programa PIBIC/CNPq (3) Colaboradores EPAGRI/CETUBA 1,2Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL) – Unidade Acadêmica de Ciências Tecnológicas(UNITEC) Grupo de Pesquisa em Engenharia de Processos(ENGEPRO) Telefone : 55-48-3621- 3191 e-mail: dile.stremel@unisul.br Tubarão S.C – Brasil 3CETUBA/EPAGRI Telefone: 55-48-3621-1300 e-mail: juliana.vet@hotmail.com Bairro São Martinho- Tubarão S.C – Brasil Introdução A ocorrência de vibrios é algo que vem preocupando os produtores e profissionais do segmento, pois, para o controle deles vêm-se utilizando antibióticos que são adicionados à água. Embora esse tratamento tenha uma resposta mais rápida às doenças bacterianas, pode produzir um efeito contrário, pois, com o uso de antibióticos em alimentos de origem animal, a resistência da bactéria patogênica associada ao animal é aumentada e pode ser transmitida aos humanos. Mac MILLAN (apud TORO, 2005) Em 1960, Richard Parker usou pela primeira vez o termo “probiótico”, que significa “a favor da vida”. A partir daí, enfatizaram-se os estudos sobre a população de microrganismos não patogênicos presente no trato digestório, tanto dos animais domésticos como dos seres humanos. Jin et al. (apud FURLAN et al., 2004) O uso de bactérias benéficas (probióticas) para inibir patógenos através de processos naturais, é um meio mais seguro e efetivo do que o uso de antibióticos para promover a saúde animal. Objetivo O objetivo foi desenvolver um complemento nutricional a base de microrganismos, bacillus subtilis com características probióticas que permitam o fortalecimento do sistema imune e o controle de doenças comuns em cultivos de camarões, ocasionadas por microrganismos patogênicos. Metodologia Método da Difusão em Orifícios (well difusion assay). Os vibrios foram pré incubados a 28 °C por 2 dias e 5μl dessa cultura e espalhados sobre as placas de ágar. A cultura dos Bacillus pré incubada por 3 dias foi centrifugada e o líquido sobrenadante filtrado através um filtro menbrana de 0,22μm, para obter extrato livre de células. Um volume de 100 μl de extrato de Bacillus livre de células foi introduzida em poços em meio de ágar e incubado pelo o período de 24-48 h em 28°C. A atividade será definida quando o diâmetro a zona inibitória avançar em torno do poço. LEWUS e MONTVILLE (1991) Apud MAZO (2002). Método da Disco-Difusão. Inoculou-se uma alçada da colônia do vibrio em caldo peptona e incubou-se á 35°C por 24 horas. Semeou-se 0,1 ml da cultura de vibrio em placa de ágar Mueller Hinton e espalhou-se uniformemente com alça de Drigalski, posteriormente transferiu-se discos de ágar contendo a cultura de Bacillus subtilis para a placa de ágar Mueller Hinton já semeada com vibrio. Após 24 horas verificou-se o halo de inibição, TAGG e Mc GIVEN (1971) apud TORO (2005). Método de Difusão em Ágar  Para testar a produção e de metabólitos produzidos por isolados de Bacillus spp., colônias da bactéria foram transferidas para Erlenmeyers de 250 ml, contendo 100 ml de caldo BHI. Após a incubação, o caldo foi centrifugado e o líquido sobrenadante filtrado através um filtro menbrana de 0,22μm, para se obter extrato livre de células. Em placas de petri com capacidade de 20 mL, foram colocadas 3 mL dos extrato e 17 mL de ágar Mueller Hinton e após a solidificação do meio foi semedado a cultura de vibrios e acompanhou-se o crescimento comparando com uma placa testemunha. ROGERO et al(2003). • Resultados • Conclusões • Com os testes realizados não foi possível comprovar o antagonismo dos Bacillussubtillis PR29 e ATCC 9372 e de seus metabólitos sobre os isolados V. parahaemolyticus, V. fluvialise V. vulnificus. • Porém, no teste disco-difusão, percebeu-se o crescimento dos dois microorganismos, portanto não refutando a hipótese de usar Bacillussubtillis PR29 e ATCC 9372 como probióticos no cultivos de camarões. • Bibliografia • FURLAN, R.L., MACARI, M., LUQUETTI, B.C.Como avaliar os efeitos do uso de prebioticos, probioticos e flora de exclusão competitiva. 5° Simpósio Técnico de Incubação, matrizes de corte e nutrição. Balneário Camboriú, SC. 2004. • MAZO, J. Z.; SANT’ANNA, E. S.; et. al. Detecção de Bacteriocinas Produzidas por LactobacillusplantarumBN em Melaço de Cana-de-Açúcar Sob Fermentação Submersa. Boletim Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, Vol. 20, No 1, 2002. • ROGERO, SizueOta et al . Teste in vitro de citotoxicidade: estudo comparativo entre duas metodologias. Mat. Res.,  São Carlos,  v. 6,  n. 3,  2003.  • TORO, C. R.; Uso de bactérias probióticas na alimentação de camarões Litopenaeusvannameicomo inibidoas de microorganismos patogênicos e estimulantes do sistema imune. 2005. • Agradecimentos: Aos Programa UNISUL/PIBIC/CNPq pela concessão da Bolsa de Iniciação Científica e á Epagri (CETUBA) pelo apoio à Pesquisa. • Método Disco-Difusão • Após 24 horas verificou-se um halo de crescimento ao redor do disco. • Figura 01 – Halo de crescimento. • Foi feita uma lâmina com a colônia ao redor do disco de ágar e feita à coloração de Gram e constatou-se a presença de bactérias Gram positivas e negativas Figura 02. • Figura 02 – Microscopia de varredura, lente de aumento 1600 vezes. • Método Difusão em Ágar • Os testes foram realizados em duplicata e com testemunha, em dois tipos de ágar e com três espécies de Vibrio. Observou-se crescimento das três espécies de Vibrio, portando não houve inibição pelo extrato dos bacilos. • Método da Difusão em Orifícios (welldifusionassay) • Após 24 horas de incubação constatou-se a não ocorrência de halo de inibição. • Figura 03 – Placas teste difusão em orifícios. (A) Tratamento com Bacillussubtillis ATCC9372, (B) Tratamento BacillussubtillisPR29. V. fluvialis V. parahaemoelyticus V.vulnificus