MS/MS Espectrometría en Tándem: Información estructural de pequeñas moléculas

1. Espectrometría de masa MS/MS Espectrometría en Tándem: Información estructural de pequeñas moléculas Secuenciación de péptidos

2. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tándem Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos” mp+ md+ + mn0 Aplicaciones: Identificación de moléculas Secuenciación de péptidos “al vuelo” Modificaciones posttraduccionales

3. Espectrometría de masa 1 péptido seleccionado para MS/MS + + MS/MS + + + + MS/MS: Secuenciaciónpeptídica Mezcla de péptidos Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Espectro MS Carlos Cerveñansky

4. Espectrometría de masa

5. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Fragmentación peptídica C-terminal N-terminal La fragmentación más común se da en el enlace peptídico, generando fragmentos b e y Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

6. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Fragmentación peptídica Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

8. Espectrometría de masa b ions y ions b1 b2 b3 b4 y4 y3 y2 y1 Las m/z medidaspor MS/MS se comparan con tablas de masasteoricasobtenidas con la secuencia del peptido, quepuede ser obtenida de bases de datos http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html

9. Espectrometría de masa + + + + F L G K F L G K + + b3 y1 F L G K + + + + CID F L G K F L G K b2 y2 + F L G K + + + + F L G K F L G K b1 y3 y1 y3 b1 y2 b3 b2 Relative Intensity K G L F K F L G m/z Para asignar los iones b/y tenemosqueconocer la secuencia de aa. Se puedehacersecuenciacion “de novo” perorequiereexperimentosadicionales e instrumentos de altaresolucion

10. y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13 Fragmentacion de Peptidospor MS/MS His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lys y9 887.6 100 y10 90 986.6 80 y8 70 y12 774.5 b5 Relative Abundance 60 y12* 1186.7 494.3 y11 b6 y13 1168.7 50 1085.7 y7 1243.7 607.4 40 673.5 b4 b11 b12 b8 30 395.2 b5* 1006.6 b6* 1119.6 b7 b13 779.5 476.3 20 772.5 885.6 589.3 a12 708.4 a5 984.6 1184.7 b10 466.3 10 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z

11. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Cómo se hace?

12. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-Q Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 Selecciona el ion molecular “padre” Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten (CID) Q3 Analiza los iones “hijo” Q1 Q2 Q3 Analyse Fragment Masses Fragment Select Parent

13. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-Q Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q2sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten CID: CollisionInducedDissociation Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS

14. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem peptides peptides + + + + + + + + Mass Analysis Ionization protein Digestion MS m/z

15. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem peptide fragments protein peptides ++ + + + ++ ++ + + + + + + + + ++ + Mass Analysis Digestion Ionization Isolation Fragmentation Isolation MS MS/MS m/z m/z m/z

16. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-IT IT: Trampa de Iones La trampa de iones puede analizar los iones de una muestra  MS También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa Luego se aceleran los iones para que choquen con Helio y se fragmenten Luego se analizan los iones hijo CID: CollisionInducedDissociation Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn se seleccionan iones hijo  se fragmentan, analizan, seleccionan uno  fragmentan, analizan, seleccionan uno  hasta que les de la sensibilidad MS2

17. Espectrometría de masa Tandem en el tiempo Fragment 426.7 Isolate Parent Ion Intact ions Intact ion This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap Daughters

18. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem MALDI-TOF Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post SourceDecay

19. Espectrometría de masa Linear Extraction plate Reflector detector grids detector Timed ion selector Reflector Laser Beam guide Camera Pumping Pumping ESQUEMA:Instrumento de tecnología MALDI-TOF

20. Espectrometría de masa

21. Identificación de sitios de modificaciónOxidación de citocromo c Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses Y74 Y74 Y67 Y67 Y48 Y48 Y97 Y97

22. aPLPC TOCL [H2O2] 37°C,1 Hr

23. b6 y4 Y+16 y12 y11y10y9y8y7y6y5y4y3y2y1 T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---K b1 b2 b3b4b5b6b7b8b9b10b11 b12 y5 b7-CO (2+) y7 (2+) b5 y6 (2+) b7 y5 (2+) b8 b10 y9

24. GAPDH Reactionwith Nitro-oleicacid BatthyanyJ.Biol.Chem. 2006, p.20450

25. Espectrometría de masa Identificación de proteínas Peptidemassfingerprinting y proteomica

26. Espectrometría de masa Identificación de proteínas

27. Huella peptídica Cada proteína, cortada con una proteasa de especificidad conocida, da una serie de péptidos de masa determinada que puede ser usada para identificar la proteína (huella peptídica) En el 2003 se terminó de secuenciar el primer genoma humano. De la secuencia del ADN se puede determinar la secuencia de aminoácidos de todas las proteínas potencialmente expresables. Hoy contamos con cerca de 20.000 Genomas secuenciados, y mas por salir.

28. Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367] 12366.46 6.0E+4 100 90 80 6187.17 70 12583.58 60 50 % Intensity 12326.17 40 30 6292.68 20 12784.48 10 0 0 5000 7000 9000 11000 13000 15000 Mass (m/z) Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

29. Secuencia AA citocromo c de caballo GDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWK EETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE Digestiónin silico portripsina (cortadespues de K o R) Lista de péptidosteóricos GDVEK GDVEKGK GK GKK IFVQK IFVQKCAQCHTVEK CAQCHTVEK CAQCHTVEKGGK GGKHK TGPNLHGLFGRK TGQAPGFTYTDANK NKGITWK EETLMEYLENPK KYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE Se calculanlasmasasteóricasparatodos los péptidosposibles y se comparan con los resultados de MS de cytctratado con tripsina

30. Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883] 2.0E+4 163 3 . 8 2 100 1168.61 90 80 70 60 % Intensity 50 1190.54 40 1212.53 1433.76 30 1655.59 1170.18 1213.53 20 1296.68 1152.36 1046.18 1631.62 1350.70 1478.82 1124.52 1230.50 10 0 0 1000 1160 1320 1480 1640 1800 Mass (m/z) B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico

31. Niveles de información……… en la caracterización de proteínaspor MS. • medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental • medidas de masas en mapeo peptídico5-20 valores experimentales • secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información

32. Peptide fragmentation fingerprinting PFF = ion search MS/MS database matching Protein(s) Peptides Ions peaklists MS/MS spectra of peptides Enzymatic digestion 340.695086 676.96063 498.8283 545.564 1171.967066 261.107346 342.51458 456.727405 363.268365 Result: ranked list of peptide and protein candidates Match In-silico fragmentation • MAIILAG • MAIILA • MAIIL • MAII • MAI • M • M • AIILAG …MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV … In-silico digestion - MAIILAGGHSVR - FGPK - AFAEVNGETFYSR - VITLESTNMFNEIIIK - YPNVVIDDENNDK … 361.107346 338.695086 676.96063 498.8283 1045.564 1171.967066 342.51458 457.827405 263.268453 Theoretical fragmented peptides Sequence database entry Theoretical proteolytic peptides Theoretical peaklist

33. Proteoma • El término “proteoma” fueacuñadopor Marc Wilkins en 1995, como el complemento de PROTEínas al genOMA • Es el productofinal del genoma másvariedad • Es unaentidaddinámica Fenotipo • Modificacionesposttraduccionales • No todos los genes se expresan como proteínas en todos los estadios/tipos celulares

34. Proteoma • Del gen a la proteína final, pueden ocurrir muchas modificaciones que no son predecibles por la secuencia de ADN original • 1 gen ya no equivale a 1 proteína

35. Sujetos de estudio de la Proteómica • Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint) • Comparación de niveles de expresión de proteinas • Función de Proteinas • Modificacionesposttraduccionales de Proteinas • Localización y Compartimentalización de Proteinas • InteraccionesProteina-Proteina

37. Quantitativeproteomics

38. Quantitativeproteomics

40. MS-Imaging

41. MS-Imaging

43. Conclusiones La espectrometría de masa es una técnica con muchísimas aplicaciones y aún tiene mucho potencial por desarrollar