Minőségi azonosítás

1. Minőségi azonosítás • Minőségi azonosításra a retenciós időt, illetve a relatív retenciós időt használjuk. • Kováts-féle retenciós index – szerves vegyületek homológ sorain belül az egyes alkotók redukált retenciós idejének a logaritmusa a C atomszám lineáris függvénye. I = 100n.

2. A Kováts féle retenciós index adott vegyületre, adott állófázison, izoterm körülmények között független az oszlop méreteitől, a nyomáseséstől és az áramlási sebességtől. • Apoláris állófázison mért retenciós index egyenes arányban van a forrásponttal, tehát a vegyület forráspontja közelítőleg meghatározható. • Poláris alkotók indexének hőmérsékletfüggése nem mindig lineáris. • Hasonló szerkezetű vegyületeknél azonos helyettesítések a retenciós indexet azonos mértékben változtatják meg.

4. Mennyiségi elemzés • Kalibrációs módszer - külső standard módszer Különböző ismert koncentrációjú oldat kromatográfiás csúcs alatti területét mérjük, majd ezek felhasználá-sával kalibrációs egyenest készítünk, melynek iránytangense az érzékenység. Ismeretlen minta koncentrációja az általa szolgáltatott terület / az érzékenység: Kalibrációs egyenes képlete Ai: az i-edik komponenscsúcsterülete, wi az i-edik komponens mennyisége

6. Belső standard módszer • Egy ún. belső standardot - mindig azonos mennyiségben hozzáadunk, mind a kalibráló oldatokhoz, mind a mintákhoz. A relatív érzékenység (fi) használatán alapszik. • Előnye, hogy kiküszöböli a térfogatos mintabevitelből adódó hibát (a minta komponenseinek teljes és pillanatszerű elpárologtatásának hiánya). Kalibrációs egyenes képlete Ai = ai + bi wi AS Asa belső-standard csúcsterülete az aktuális kromatogramban, wi az i-edik komponens mennyisége a belső standard mennyiségével osztva.

7. Származékképzési reakciók • Célja: a mérendő komponens átalakítása valamilyen speciális kémiai reakcióval, annak érdekében, hogy a keletkezett termék könnyen gázkromatografálható legyen. • Illékonyság és termikus stabilitás növelése. • H-hídképzés csökkentése → csúcsalak javítása • Átalakítandó funkciós csoportok: • - OH, - COOH, -NH2, - SH, stb. • LOD értékek csökkentése – ECD detektornál : halogéntartalmú származékképzés

8. Származékképzés hatása

9. Legfőbb típusaik • Szililezés • Alkilezés • Acilezés 1, SZILILEZÉS Aktív hidrogén lecserélése általában trimetil-szilil csoportra. Általánosan: 3 Reakció hatásfoka a szililezőszer erősségétől és a kémiai reakcióban résztvevő funkciós csoport minőségétől függ.

10. Szililezhetőségi sorrend: • Alkoholok > Fenolok >Karbonsavak >Aminok>Amidok>Tiolok • Sztérikus hatások: • Primer alkoholok > szekunder alkoholok > tercier alkoholok • Reakció feltételei: • A reagenst feleslegben alkalmazzuk. • 100 %-osnak kell lennie az átalakulásnak. • Reakció körülmények optimálása (60-80 0C, 10 – 120 perc, katalizátor). • Lehetőleg egyfajta származék keletkezzen (több funkciós csoport esetén), több csúcs keletkezése probléma!

11. Leggyakrabban alkalmazott szililezőszerek reaktivítási sorrendben

12. Xvégső = NH3 Reakciómechanizmus: Nukleofilszubsztitució Kivitelezés: Oldószer nélkül, csak a szililezőszerrel Oldószerrel (aprotikus): piridin, toluol, acetonitril, hexán Katalizátorok: trifluoro-ecetsav (TFA), trimetil-klór-szilán (TMCS) Egyéb követelmények: Szililezőszerek nagytisztaságúak és vízmentesek legyenek és ne zavarják az elválasztást (koelució mentes). Származékolandó minta vízmentessége! Könnyen hidrolizálnak víz és alkoholok hatására. Stabilitás vizsgálat.

13. 2, ALKILEZÉS Aktív hidrogéneket alkil csoportra cseréljük. Pl. Alkohol → Éter; Karbonsav → Észter Fajtái: 1, Alkilhalogenidek (jodidok, bromidok) R-OH + CH3-I → R-O-CH3 + HI Fenolok, karbonsavak, tiolok Katalizátor: ezüst-oxid 2, Diazotálás (diazometánnal, mérgező) R-OH + CH2N2 → R-O-CH3 + N2 Fenolok, karbonsavak, szulfonsavak

14. 3, ACILEZÉS • Aktív hidrogéneket acil csoportra cseréljük • Pl. Alkoholok → Észter, Aminok → Savamid • Savanhidridek és savkloridok használata Legáltalánosabban használt reagensek: 1, trifluoroecetsav-anhidrid (TFAA) 2, pentafluoropropionsav-anhidrid (PFPA) 3, heptafluorobutánsav-anhidrid (HFBA)

15. A halogén atomok bevitelével lehetőség nyílik az ECD detektor használatára, ami érzékenység növekedést jelent. • A reakciót vízmentes körülmények között hajtják végre, majd ezt követi a reagens feleslegének eltávolítása bepárlással, vagy gyenge bázis vizes oldatával való elreagáltatással. • A fluorozott származékoknak nagyobb az illékonysága, mint a többi perhalogénezett származéké.

16. A GÁZKROMATOGRÁFIA ANALITIKAI ALKALMAZÁSA • Kőolajipar, petrolkémiai ipar • Környezetvédelmi analízis • Gyógyszeripari elemzések • Oldószermaradványok elemzése • Élelmiszer analitika (aromaanyagok, toxinok, szermaradványok) • Kozmetikai ipar (illatanyagok).

17. NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.

18. HPLC FELÉPÍTÉSE

19. OLDÓSZEREK • Üveg, vagy műanyag edények. • Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). • Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O2 eltá-volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. • Gázmentesítés megvalósítása: • - melegítés; • - vákuum alkalmazása; • - ultrahangos szonikálás (rázatás); • - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). • Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.

20. SZIVATTYÚK • Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás • Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). • Pulzáláscsillapító

22. Pulzáláscsillapító 1, tekercs - flexibilis 2, membrán – hexánnal töltve 1 2

23. Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm-es saválló acél). • Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). • Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus). GRADIENSKÉPZŐ • Izokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázis • Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás-szerű változtatása.

24. Mintainjektáló rendszer • Injektált mennyiség (analitikai): 5-100 μl • Fajtái: • Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). • Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).

25. Kézi injektálás

26. Automata mintaadagoló

27. Loop méret alapján Mikro: 0,06 µL - 0,500 µL Analitikai: 1,0 µL - 500,0 µL (5-100 µL) Preparatív: 100 µL - 10 mL

28. OSZLOP • Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. • 10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. • Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). • Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m2/g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. • Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé-rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. • Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens).

29. NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. • Szilikagél • Aluminium-oxid • Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez 500-1000-red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése.

30. Szabad szilanol csoport (gyenge sav) • Módosított szilikagél Szubsztituáltklórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukáltdipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

31. Módosított szilikagél

32. Mozgófázis • Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá-zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása Δp = LFηφ ᴨr2 dp2 L = oszlop hossza F = térfogati áramlási sebesség η = viszkozitás φ = az oszlop porozitására jellemző tag r = oszlop átmérő; dp = átlagos szemcseméret

33. ALKALMAZÁSA • Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). • Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal • Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)

34. FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis • Módosított szilikagél • Szerves polimer alapú állófázisok • Szén alapú állófázisok

35. Savas hidrolízis helye OH OH CH3 CH3 Si Si Si OH Cl Si O + C18H37 C18H37 -HCl CH3 CH3 OH OH Szabad szilanol csoport Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal).

36. A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat-lan marad. • Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) • Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: pH = 10-11 • Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. • Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

37. Mozgófázis • Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. • Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol<acetonitril<eta-nol<tetrahidrofurán. • Ionizálható minta esetén pH kontroll kell. Alkalmazott pufferek: foszfát/foszforsav, acetát/ecetsav, ammónia/ammónium-klorid.

39. Funkciós csoportok polaritása: C-H < C-O-C < C-N-C < CN < C=O < HO-C=O < OH

40. Gradiens elució A módszer előnyei: • Az analízis ideje lecsökken. • A felbontóképesség javul. • Keskenyebb csúcsok. • Nagyobb érzékenység. Gradiens elució Izokratikus elució

41. Gradiens programozás

43. Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében Szénatom szám

44. A pH szerepe az elválasztásban • Semleges vegyületek – nincs pH hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. • Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálódnak • Ionos vegyületek – pH és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: • pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása • Ionpárképzés • Ioncsere kromatográfia

45. Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében RCOOH RCOO-/RCOOH pKa RCOO-

46. A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztására tailing

47. Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében R-NH2 R-NH3+/R-NH2 pKb R-NH3+

48. A pH hatása bázikus vegyületek elválasztására Bázikus antihisztaminok (pH=11 !!!)

49. Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC) • A retenció növelése érdekében az eluensbe 1-100 mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval.

50. [Molekula ION]- N+ C18 állófázis Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése