Metagenômica

1. BMP 5762 – BioinformáticaAplicadaaoEstudo de DoençasParasitárias Prof Dr Arthur Gruber Instituto de CiênciasBiológicas Metagenômica Carla Bartels Francisco M UlloaStanojlovic Luis Fábio Batista

2. O termoMetagenômicafoiusadoprimeiramenteem 1998 por Jo Handelsman (Universidade de Wiscosin – EUA) Dr. Anand Kumar & Dr. R. A. Siddique

3. Introdução METAGENOMA É o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat. METAGENOMA É o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat METAGENÔMICA É a análise genômica das comunidades de microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo. Dr. Anand Kumar & Dr. R. A. Siddique

4. Handelsman, 2004

5. Metagenômica Fornece a informação da capacidade metabólica e funcional da comunidade microbiana Metatranscritoma Permite a identificação de genes que estão ou não sendo expressos Metaproteômica Permite uma melhor caracterização funcional da comunidade microbiana Dr. Anand Kumar & Dr. R. A. Siddique

6. Metagenômicaaplicada Dr. Anand Kumar & Dr. R. A. Siddique

7. Metagenômicafornece Thomas et al, 2012

8. JCSetubal, 2012

9. JCSetubal, 2012

10. JCSetubal, 2012

11. Binning Thomas et al, 2012

12. Handelsman, 2004

13. Amostragem • Isolar o DNA • Depende do tipo de amostras • Clonar DNA • Inserirdentro de um vetor (plasmídio, cosmídio, BAC) • Biblioteca • Screening e sequenciamento Daniel, 2005 em Prentice Hall, 2005

14. Amostragem {desafios} • Amostrasdevemrepresentar a população→ Quantasamostrassãonecessárias? Curvas de raridadeparaestimarfração de espéciessequenciadas. (Abundância x Complexidade). • Presença de populaçõesdominantesafetaanálises → representaçãomaior e maior chance de montarcontigs. • Quantomaismetadadosforemcoletadosmaisdetalhadasserão as inferências das condiçõesambientais. Ex.: dados geográficos, bioquímicos, data de coleta, métodos de extração do DNA. Bruno MalveiraPeixoto 2011

15. Sequenciamento – Shotgun Genomacompleto Hierárquico Commins, Toft, Fares, 2009

16. Prakash and Taylor, 2012

17. Montagem • Fatores a seremconsiderados: • Tamanho das leituras de sequenciamentousadasparacriar a base de dados de metagenômica • São necessáriassequênciasmaislongasparaanotação? • A base de dados estámontadaparareduzirosrequerimentos de processamento de dados?

18. Montagem Montagem baseada em referência: MIRA: AnAutomatedGenomeand Assembler • Algoritmos rápidos rodam em laptop em 2h; • Regiões divergentes não são cobertas – inserções, deleções ou polimorfirmos. Montagem “de novo”: Velvet Meta-IDBA MetaVelvet • Baseados em gráficos de Bruijn • Requer grandes recursos computacionais • Requer milhares de gigabytes – dias. • Meta-IDBA e MetaVelvet – não clonalidade de populações naturais - subgráficos de Bruijn - N50 e tam. contig Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

19. Montagem {limitações} • Amostragemincompleta – genomasparcialmenteamostrados • Formação de quimeras – sequências de espéciesdiferentes • Dificuldadeemmontaramostrasricasemespécies (solo). Bruno MalveiraPeixoto 2011

20. Métodos de Discriminação • Pontosimportantesa considerar: • Tipo de dado de entradadisponível • Existência de training datasets adequadosougenomas de referência • Algumasferramentascombinamosdoisapproachs – PhymmBl, MetaCluster Thomas et al, 2012; Liu, 2012

21. ClassificaçãoComposicional • Genomastêmcomposição de nucleotídeosconservada e istoserárefletidonosfragmentos de sequência dos genomas • Conteúdo de GC • Uso de códons • Sítios de reconhecimento – 5S ou 16S rRNA • Bioinfo tools: • Phylopythia • S-GSCM • TACAO • Nãofuncionabem com leiturascurtaspornãocontereminformaçõessuficientes Thomas et al, 2012; Liu, 2012

22. Conteúdo GC • Karlin & Burge, 1995 • A distribuição de nucleotídeosérelativamenteconstantedentro do genoma, mas varia entre genomas. • A razão de possibilidades (odds ratio) de frequência de conteúdo C+G éessencialmente a mesmanamaioria dos organismosparatodo o DNA versus o DNA codificante e também a mesmapara as frações de DNA das diferentessequências. • Talvezexistamfatoresqueimponhamlimitesàsvariaçõescomposicionais e estruturais de um genoma e que o conjunto de valores das odds ratios do dinucleotídeosejaumaassinaturagenômica. • Diferençassignificativas entre procariotos e eucariotos, entre vírus e seushospedeiros. • Pxy = fxy / fxfy Karlin, 1995; Liu, 2012

23. Karlin, 1995

24. Karlin, 1995

25. Uso de códons Karlin, 1998; Ikemura, 1985

26. Similaridade • Comparaleiturascurtas contra sequênciascodificadoras de bases de dados públicas de genes usandoBlastX e entãodesignapara o seu ancestral comummaistardio (LCA) de um organismoalvo • Bioinfo tools • IGG/M • MG-RAST • MEGAN • CARMA • Sort-ITEMS • MetaPhyler Thomas et al, 2012; Liu, 2012

27. Classificação {Bioinfo} • Análise de similaridade: IMG/M, MG-RAST, MEGAN, CARMA, Sort-ITEMS, MetaPhyler • Análise composicional: Phylopythia, S-GSOM, PCAHIER, TACAO • Similaridade e composicional: PhymmBL e MetaCluster Necessidade de sequências de referência* (marcador de RNAr) para fechar o alinhamento para sequenciamentos de leitura curta. * Base de dados escassas e tendenciosas para apenas três filos Proteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria Bruno Malveira Peixoto 2011 Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

28. ANÁLISES DOS DADOS • Dados de metagenômica cada vez mais abundantes necessitam de banco de dados para cobrir as informações taxonômicas e funcionais • Plataforma computacional robusta, combinado com programas de pesquisa de similaridade adaptados a esses dados.

29. Anotação • Contigs longos ≥ 30.000 pb: RAST ou IMG • Contigs curtos • Fase 1: identificação dos genes: FragGeneScan (FGS) 1-2% erro, MetaGeneMark (MGM), MetaGeneAnotator (MGA), Metagene e Orphelia • Fase 2: identificação atribuição de função e agrupamento taxonômico

30. Pipelines Sistema aberto que processa automaticamente as sequências de metagenomas, faz comparações com bases de dados existentes, computa reconstruções filogenéticas e classifica funcionalmente potenciais genes. • Usa FGS, Greengenes , RDP e similaridade por RNAr • Usa bases de dados funcionais de ontologia GO (KEGG, eggNOG, COG/KOG, PFAM e TIGRFAM). Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

31. Pipelines • Usa FGS, MGA e taxonomia baseada em 16S RNAr • Usa bases de dados funcionais de ontologia GO (KEGG, eggNOG, COG e SEED). Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

32. Pipelines • Usa FGA e MGA • Oferece esquema de anotação mais flexível • Requer o uso do mesmo workflow para análise Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

33. Pipelines MEGAN

34. Aplicações

35. Aplicações • Identificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicas • Estimar a diversidade microbiana; permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todo • Compreender a dinâmica da população de uma comunidade inteira.

36. Saúde

37. Bioenergia

38. Metabolismo animal

39. Identificação novos patógenos

40. Vigilância

41. Medicina forense

42. BIOPROSPECÇÃO FUNCIONAL SEQUÊNCIAS

43. BIOPROSPECÇÃO

44. ESTUDOS ECOLÓGICOS Primeiros estudos • Mar de Sargaços • Comunidade complexa • Genes desconhecidos • Filotipos novos • Impossibilidade de sequenciar todos os genomas presentes na amostra

45. Projetos recentes • Global Ocean Sampling (GOS) Fonte: http://camera.calit2.net/about/gos.shtm

46. Microorganismos representam mais de 90% da biomassa do oceano, mediam todos os ciclos bioquímicos nos oceanos e são responsáveis ​​por 98% da produção primária no mar.Metagenômica é uma abordagem inovadora de sequenciação para examinar as espécies microbianas de espaço aberto sem a necessidade de isolamento e cultura de laboratório de espécies individuais. Alves, 2007

47. Projetos recentes

48. Projetos recentes

49. Fluxograma comparativo de projetos genoma tradicionais e metagenômicos

50. OBRIGADO!