病毒类疫苗生产技术

病毒类疫苗生产技术

病毒疫苗的一般制造方法

一　病毒类疫苗的制造方法 • 1　毒种的选择与减毒 • 毒株须具备的条件： • （1）持有特定的抗原性； • （2）有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性； • （3）易在特定组织中大量繁殖； • （4）不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；

（5）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；（5）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象； • （6）未被其它病毒污染。 • 2　病毒的繁殖 • （1）活体动物培养 • （2）鸡胚培养 • （3）组织培养

（4）细胞培养； • 细胞培养时需要控制： • ①　常用的维持液和生长液 • 　　需要氨基酸、辅酶、维生素、葡萄糖和无机盐等。 • ② 培养条件控制 • a pH值：7.0±0.2； • b CO2提供：通过保持环境CO2分压5%，控制pH。

c 氧的提供：通氧； • d 容器内壁洁净度控制：用硫酸－铬酸混合液洗涤，后用纯水冲洗； • e 细菌污染控制：彻底灭菌，加入一定量抗生素； • f 培养温度和时间控制：37±1℃，时间2－4天。

3　疫苗的灭活 • 　　用甲醛或酚溶液灭活。 • 　　动物组织对灭活效果有影响；灭活时间要合适。 • 4　疫苗纯化 • 　　细胞培养换液即可。

5　冻干 • 　　冻干的疫苗充氮或真空密封保存。

重要的病毒类疫苗生产工艺 • 一、甲型肝炎减毒活疫苗 • 历史：绒猴肝内复制； • 细胞培养未经纯化； • 细胞培养经纯化。

二　乙型肝炎疫苗 • HBsAg抗原具有较强的免疫原性，可制备疫苗，用酵母表达系统。

流行性感冒疫苗 • 生产工艺 • 世界卫生组织每年进行监测和预测。 • 要求：多价 • 将病毒接种于9~10日龄鸡胚胎尿囊腔中→32~34度培养48至80小时→收取尿囊液和羊水→蔗糖梯度离心（30至55%，25000r/min,15度，8h)

→灭活（－丙烯内酯1：6000，20℃,72h)

流行性乙型脑炎疫苗 • 　　以Vero细胞为基质，可用15L转瓶或50L微载体培养。毒种接种后培养3天开始收获病毒，每2天收1次，可收4至5次。收获液先用甲醛灭活，用超滤浓缩10至20倍，用硫酸鱼精蛋白处理，去除DNA。再进一步纯化：

方法一：蔗糖密度梯度离心 • 36%至60%蔗糖为介质，对粗制纯化产物进行速率离心，23000r/min4h，收集38%区带，除糖。 • 方法二：凝胶层析法 • Sepharose CL-6B 去小分子，用Sephacryl S-500HR去大杂质。

第四节　乙型肝炎疫苗生产工艺 • 目前，乙型肝炎疫苗属于二代疫苗，即蛋白苗，乙肝表面抗原。 • 重组CHO细胞乙肝疫苗 • 　　将乙肝表面抗原基因拼接入CHO细胞染色体中。 • 　　培养细胞后收获培养液按如下纯化：

方法一：沉淀　超速离心　凝胶层析 • 　　用50%饱和度硫酸铵沉淀两次→用KBr等密度梯度离心→Sepharose 4B层析→洗脱。

方法二：三步层析法 • 　　第一步　Butyl-S-Sepharose FF 疏水层析； • 　　第二步　DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析； • 　　第三步　Sepharose 4FF凝胶层析。

纯化的抗原用甲醛（1：4000）37度72h，经微滤、超滤，加氢氧化铝吸附。纯化的抗原用甲醛（1：4000）37度72h，经微滤、超滤，加氢氧化铝吸附。

重组酿酒酵母乙肝疫苗 • 　　发酵后纯化方法同前。 • 用硅胶吸附→粗品→用疏水层析进一步纯化→微滤→加氢氧化铝吸附。

第五节　联合疫苗 • 联合疫苗：能够预防多种疾病的联合制品。