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4 分子量決定法

4 分子量決定法. 4.1 膠体過濾法： 依蛋白質分子量的大小來做分子量測定 4.2 梯度電泳法： 可佐證分子量的測定 4.3 其它分子量測定方法： 4.3.1 超高速離心法 4.3.2 由胺基酸序列計算分子量 4.3.3 質譜儀分析. A. Vo. Ve. Vt. 0. ■ 膠体過濾的溶離圖譜：. Y. X. E. Enzyme activity . Z. Elution Volume (mL). 252 kD. 252 kD. 98. 98. 64. 64. 50. 50. 36.

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4 分子量決定法

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Presentation Transcript

  1. 4分子量決定法 • 4.1膠体過濾法： • 依蛋白質分子量的大小來做分子量測定 • 4.2梯度電泳法： • 可佐證分子量的測定 • 4.3其它分子量測定方法： 4.3.1 超高速離心法 4.3.2 由胺基酸序列計算分子量 4.3.3 質譜儀分析

  2. A Vo Ve Vt 0 ■ 膠体過濾的溶離圖譜： Y X E Enzyme activity Z Elution Volume (mL)

  3. 252 kD 252 kD 98 98 64 64 50 50 36 36 以電泳及抗體檢定表現蛋白質 ← 純化步驟順序 ← 純化步驟順序 AF IEX GF TP XT marker AF IEX GF TP XT marker GUS GUS 10% SDS-PAGE Western Transfer MW = 70 kD

  4. 6 10 1.6 x 90 cm Buffer A-150 a typical result 5 260 kD 10 = 4 70 kD 4 10 3 2 3 10 Vitamin B12 1 目測 0 Elution Volume 以膠體過濾法求得GUS 原態分子量 Sephacryl S-300 分子量 + MW=260 kD GUS

  5. % 若在高限溶液中 加入少量染劑 5 20 ■ 梯度電泳片的製備： ●以電泳測定原態分子量的條件： (1) 樣本蛋白質的 pI < 8.0 (2) 使用梯度電泳膠體 (3) 電泳進行較久 梯度製造器 5% 20% 可觀察所拉梯度是否均勻 由下方開始 注入梯度溶液

  6. 1 2 3 4 Migration (cm) ■ 原態分子量測定： Disc-PAGE kD 900 800 700 600 500 400 300 200 100 kD 669 440 232 140 SS Mol mass ●不能以 disc-PAGE 為唯一分子量證據

  7. P1 P2 P3 P4 Search Database Candidate protein Digestion Simulation Calculate Mol wt MW4 MW4 MW2 MW2 MW3 MW3 MW1 MW1 ■ 質 譜 儀 可 檢 定 蛋 白 質 身 分 ： Unknown protein Protease digestion MALDI-TOF m/z ● 比對各片段分子量可確定該蛋白質身分

  8. Phosphorylated protein Protease digestion P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 P P LC P4 ESI-Mass/Mass ■ 質 譜 儀 可 進 行 蛋 白 質 序 列 分 析 ： Unknown protein Protease digestion LC P4 ESI-Mass/Mass R V W S G ● 也可定出磷酸化位置 K G ● 質譜儀可直接定序 -GKGSWVR

  9. 5蛋白質構造與組成分析 • ●5.1 N-端或C-端胺基酸決定： • 通常都直接定序，C-端較為困難 • ●5.2胺基酸組成分析 • ●5.3 胺基酸定序法： • 5.3.1cDNA 間推法 • 5.3.2Edman 直接定序法 • ●5.4 胜圖譜 • ●5.5 其它相關方法

  10. N-terminal ■ 決 定 N 端 胺 基 酸 ： 以紫外線顯色 Dansylation 只有 N-端胺基酸 會被修飾 HCl hydrolysis 2D chromatogram TLC TLE 胺基酸水解液 TLC plate

  11. 1st dimension O 2nd dimension ● 二次元薄層層析電泳可分離出二十種胺基酸 ■ 以 薄 層 層 析 法 鑑 定 胺 基 酸 ： TLC Arg H2O - Formic acid Dans OH TLE Benzene - Acetic acid

  12. ■ 蛋白質酸性水解： ●水解試劑： 6 N HCl / 4 N methanesulfonic acid ●水解條件： 真空下110 度24 小時 ●檢測方法： 以HPLC(離子交換法)分離各胺基酸 ●結果注意： 有些胺基酸被破壞(Trp) Cys-Cys 斷裂成為Cys Gln 及Asn 酸化成為Glu 及Asp (Glu, Gln → Glx; Asp, Asn → Asx)

  13. Lys His Gly Ser Arg Leu Ala Thr Met Ile Glu Asp Val Phe NH4+ Tyr (Pro) Cys Intensity ■ 以 液 相 層 析 分 離 鑑 定 胺 基 酸 ： 0 10 20 min

  14. 1 2 1 PTH- 2 1 2 Edman degradation ■ 決 定 胺 基 酸 序 列 ： N- Peptide + PITC PTH- PTH-胺基酸 裂解 切除 N-端胺基酸 的剩餘部份 Amino acid analysis Second cycle + PITC

  15. 蛋白質體分析工具建立 Edman degradation 大型二次元電泳 蛋白質序列分析

  16. 5.4 胜圖譜： • 5.4.1蛋白質的專一性水解： • ■專一性內切： • Trypsin, Chymotrypsin, Sa protease • ■化學反應法：CNBr • 5.4.2 檢定胜群的方法： • TLE/TLC HPLC SDS-PAGE

  17. ■ 蛋白質的專一性水解： 使用專一性蛋白 Protease Cutting Sites 變 性 蛋 白 質

  18. 色析 電泳 ■ 以 雙 向 層 析 電 泳 鑑 定 胜  ： Hemoglobin A Hemoglobin S 鎌 型 血 球 血 紅 蛋 白 四 號 片 段

  19. PTH- ■ 以傳統胺基酸定序法決定蛋白質序列： Peptide N- 使用兩種不同的蛋白質水解酵素 + PITC (Edman degradation) 每片段 分別定序 檢定胺基酸種類 依序排出胺基酸序列 1-2-3-4-5-6--- 由兩組序列推出整段

  20. F NH3+ V +NH3 N Q G H I V L V L H E C E S G A Q S S L C C Y S T -OOC L S S V N I C S C S S C Y COO- L G N T Y E E L Q K R P G T F Y F ■ 以傳統胺基酸定序法決定蛋白質序列： F. Sanger (1980, Cambridge U) Insulin 胰島素(A, B chains) B-chain A-chain Nelson & Cox (2000) Principles of Biochemistry (3e) p.142

  21. 6免疫學工具的利用 ●6.1抗原製備 ●6.2免疫流程 ●6.3抗體製備 ●6.4 抗體的應用

  22. ■ 抗原的種類： ●巨分子抗原：酵素, DNA, 菌体 蛋白質、多醣体、核酸 ●小分子抗原：無法直接免疫 要先接到巨分子(carrier) 上 ●半抗原(hapten)：紅麴毒素 也要接到巨分子 carrier ●人工合成胜： 也要接到巨分子carrier 可得monospecific Ab KLH or BSA

  23. ■ 基礎免疫學： ●免疫系統：先天及後天免疫系統 ●免疫反應：遭遇→動員→掃蕩→休止 ●抗体分子：有兩個專一性抗原結合區 ●單株抗体：只對其專一性抗原基作用

  24. Trial Bleeding Titer Determination Total Bleeding, < 1 mL Ascites Fluids ■ 小 白 鼠 免 疫 流 程 ： 加佐劑製成乳劑 Antigen (50 mg/mouse) Emulsified in 0.5 mL Freund's Complete Adjuvant BALB/c 0 2 4 6 8 10 12 14 wk At least three booster shots, same dose in 0.5 mL Freund's Incomplete Adjuvant Booster shots might be reduced if TiterMax is use as adjuvant 全採血 Pristane (0.5 mL) NS-1 Cell (10 6 cells) X mL (X = 1-10) 腹水

  25. Ascites (X mL) Pellet Pellet Supernatant IgG (stored in freezer) ■ 免 疫 球 蛋 白 純 化 流 程 ： spin down cells (discard) + 2X mL PBS ammonium sulfate (AS) fractionation 0~40% sat. 沉澱 spin down pellet resuspended in 40% AS 清洗 spin down pellet dissovled in X mL PBS dialysis in PBS three changes 透析 spin down precipitate + glycerol (equal volume) 保存

  26. 6.4抗體的應用： ●轉印及免疫染色法：應用最廣最有效率 ●免疫沉澱法：另一種檢定專一性抗原的方法 ●親和層析法：最快速有效的純化方法 ●雙向免疫擴散法：古老但仍有其特色及應用 ●酵素免疫分析法：可分析大量樣本 ELISA ●抗體晶片：專一性地同時進行多種分析

  27. ■ 雙 向 免 疫 擴 散 法 ： ● 外圈：水稻 (R) 與玉米 (M) 中的蔗糖合成脢 中央： 抗水稻蔗糖合成脢的抗血清 spur 由沉澱線交叉情形得以推測抗原分子的關係

  28. A A A A A A A A A A A A ■ 擔 體 免 疫 沈 澱 的 原 理 及 應 用 ： 誘生抗體 細 胞 粗 抽 取 液 Ab Protein A-Sepharose Conjugation 免 疫 吸 著 劑 抗原抗體反應 離心得沈澱 洗去雜質

  29. A A A A A A 細 胞 粗 抽 取 液 ■ 擔 體 免 疫 沈 澱 的 原 理 及 應 用 ： 擔 體 免 疫 沈 澱 以 SDS-PAGE 電泳檢定 抗原可能有 兩個次體 抗原有輕鏈及 重鏈各兩條 H L

  30. L-SP L-SP Immunoprecipitation Immunoprecipitation L-SP H L Proteasome ■ 免疫沈澱證明兩分子間的親和性結合： Proteasome L-SP Anti- Proteasome Anti-L-SP Immunostaining Immunostaining Anti-L-SP Anti- Proteasome Western blot SDS-PAGE Western blot

  31. L-SP L-SP L-SP L-SP L-SP L-SP + + L-SP L-SP ■ 雙向免疫擴散也可證明兩分子間結合： L-SP + L-SP

  32. 蛋白質科技 Protein Technology 7蛋白質科技 ●7.1蛋白質科技的範疇 ●7.2蛋白質的微量分析及檢定 ●7.3蛋白質體研究

  33. 蛋白質化學 酵素化學 蛋白質體學 生物質譜學 結構生物學 蛋白質 構造與功能 蛋白質工程 應用 微生物學 生化工程學 生物 物理化學 基本生物 化學實驗 酵素化學 實 驗 蛋白質體學 實 驗 生物質譜學 實 驗 蛋白質工程 實 驗 生化工程 實 驗 抗體工具 生物資訊學 生物資訊學 實 驗 純 化 分 析 功 能 構 造 修 改 量 產 ■蛋白質科技相關課程與階段： Basic Protein Techniques Protein Structure & Function Protein Engineering Purification Analysis Structure Function Protein Eng Biochem Eng

  34. 蛋白質科技 蛋白質 抽 取 Protein Technology 快速 液相層析 蛋白質 轉印分離 二次元電泳 分析系統 影像分析 軟體系統 1 電泳及轉印 毛細管 分離系統 蛋白質 色 帶 膠內分解 片段分析 2 二次元電泳 3 膠體內水解 均 質 蛋白質 蛋白質 序列分析 毛細管電泳 分離系統 4 微量分離純化 短鏈胜 合成 胺基酸 序 列 質譜儀 分 析 微量分析系統 質量分析 MALDI-TOF 抗體製備 生物資訊學 製 備 抗體工具 生物資訊 資料庫 ■ 蛋 白 質 的 微 量 分 離 及 檢 定 ： 蛋白質純化分析

  35. Genome 基因表現不一定完全反映到蛋白質 由基因體較難預測蛋白質的修飾及調控 也無法預測蛋白質間的交互作用 Proteome

  36. N- ■蛋白質體可綜觀蛋白質的消長與身分： Proteolytic digestion Sample Pure protein Proteolytic fragments 2D electrophoresis Capillary Electrophoresis HPLC MALDI-TOF Mass spectrum Amino acid sequencing Database searching

  37. ■ 現代蛋白質科技的特點： ●高產能High-through put ●快速High-speed ●微量Micro-scaled

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