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第二章 酶的生物合成与发酵生产

第二章 酶的生物合成与发酵生产. 提取分离法 微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶. 复制. DNA. 转录. 逆转录. 蛋白质. RNA. 翻译. 复制. 第一节 酶生物合成及调节 一、酶的生物合成. 遗传信息传递的中心法则. 转录 传递给 RNA ，再由 RNA. （一） RNA 的生物合成 -- 转录 (transcription). 定义

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第二章 酶的生物合成与发酵生产

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  1. 第二章 酶的生物合成与发酵生产 提取分离法 微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法 生物合成法植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶

  2. 复制 DNA 转录 逆转录 蛋白质 RNA 翻译 复制 第一节 酶生物合成及调节 一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则 转录传递给RNA，再由RNA

  3. （一）RNA的生物合成--转录(transcription) 定义 以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。 .

  4. 转录模板 模板链（template strand）反意义链(antisense strand) 启动子（promotor) 终止子(terminator) 5´ 3´ 3´ 5´ DNA 编码链 (coding strand) 有意义链(sense strand) 反意义链:指导转录作用的一条DNA链 有意义链:无转录功能的一条DNA链.

  5. 5’ 有意义链 5’ 3’ 3’ T C G A G T A C A G C T C A T G 反意义链 RNA聚合酶 C G A G U A C G C A U 3’ PPi UTP RNA 5’ GTP ATP CTP UTP RNA在DNA模板上的生物合成

  6. RNA的转录过程(三步) 1.起始 2.延长 3.终止

  7. 原核生物的RNA聚合酶(DDRP) E. coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（ 2   ） 起始因子

  8. 启动子（promotor) 终止子(terminator)     RNA聚合酶 5 离开 3    5 3 3 5 5 5 3 5 起始 RNA合成过程 双链DNA局部解开 磷酸二酯键形成 延长阶段 解链区到达基因终点 终止阶段 RNA

  9. 模板链（反义链） 有义链 解链 复链 3´ RNA-DNA杂交螺旋 新生RNA 聚合酶的移动方向 延长部位 5´ RNA链的延伸图解

  10. （二）蛋白质的生物合成--翻译(translation) 定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。

  11. 酪 酪氨酰- tRNA 5’ 反密码 AUG GUU UAC ACA mRNA 5’ 3’ 密码与反密码的碱基配对

  12. 给 位 (P位) 受 位 (A位) 蛋 苏 大亚基 小亚基 UGU GUU AUG ACA 5’ 3’

  13. 蛋白质的合成过程（大肠杆菌） • 氨基酸的活化 • 肽链合成的起始 • 肽链的延伸 • 肽链合成的终止与释放

  14. 氨基酸的活化与转运 反应式： 氨酰-tRNA合成酶 AA + tRNA + ATP 氨酰-tRNA+AMP+PPi 对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。

  15. 在核糖体上合成多肽（三阶段） 1、起始阶段 2、延伸阶段 3、终止阶段

  16. 肽链合成的起始阶段 1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物 2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。 3.大小亚基结合 IF1 30S起始复合物

  17. mRNA 小亚基 AUG ACA 5’ 3’ 蛋氨酰tRNA GTP 给位 受位 蛋 蛋 大亚基 UAC UAC AUG ACA AUG ACA 5’ 3’ 5’ 3’ GDP+Pi 肽链合成的起始阶段

  18. 肽链合成的延伸阶段 1.进位:氨基酰-tRNA进入受位; 2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与 受位结合; 3.移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的 位置,空出受位,不断地进位、转肽、 移位,使肽链延长。

  19. 苏 蛋 蛋 苏 UGU UAC UAC UGU GUU AUG ACA AUG ACA 3’ GTP GDP+Pi 5’ 3’ 5’ 起始复合体 Mg+ K+ 进位 蛋 蛋 苏 苏 UGU UAC UGU GUU GUU AUG ACA AUG ACA 3’ 5’ 5’ 3’ GDP+Pi GTP 移位 转肽

  20. 肽链合成的终止阶段 1.出现终止密码并与终止因子结合; 2.肽键水解,多肽释放; 3.tRNA,mRNA,大小亚基解离.

  21. 终 终 UAC UAC AUG UAA AUG UAA 5’ 5’ 3’ 3’ 肽链 终 5’ UAC 3’ UAC AUG UAA 终 5’ 3’

  22. 二、酶生物合成的调节 定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。 意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。

  23. 操纵子——基因表达的协同单位 结构基因（编码蛋白质, structural gene, S） 操纵子 操纵基因（operator gene, O） 控制部位 启动子（promotor gene, P） （一）基因调控理论Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）

  24. 基因操纵子调节系统示意图 调节基因启动基因 操纵基因 结构基因 DNA 转录 （-） RNA聚合酶 （+） 转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂 操纵子 控制区 信息区

  25. 调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。

  26. 启动基因（promotor gene）（启动子）： 有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。 cAMP-CRP复合物的作用示意图

  27. 操纵基因（Operater gene）: 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。 结构基因（Structural gene）: 决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。

  28. (二) 酶合成调节的类型 1.诱导(induction) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。 2.阻遏(repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)

  29. （三）酶合成的调节机制1. 酶合成的诱导 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成； （3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。

  30. 基 因 关 闭 启动子 乳糖结构基因 调节基因 操纵基因 P O LacZ LacY Laca R mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因 表达 mRNA 阻遏蛋白（无活性） 乳糖 A、乳糖操纵子的结构 启动子 乳糖结构基因 调节基因 操纵基因 诱导 LacZ LacY Laca P O R mRNA 阻遏蛋白（有活性） B、乳糖酶的诱导 阻遏蛋白（有活性）

  31. 2.末端产物阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。

  32. 色氨酸操纵子——酶的阻遏 结构基因 结构基因 操纵基因 操纵基因 调节基因 调节基因 mRNA 辅阻遏物 酶蛋白 代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 因不能表达 阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达

  33. 调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达 阻遏蛋白(有活性) mRNA 酶蛋白 诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达 mRNA 酶蛋白 阻遏蛋白(无活性) 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达 代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达 代谢产物 A.有活性阻遏蛋白 酶的诱导和阻遏操纵子模型 B.有活性阻遏蛋白加诱导剂 C.无活性阻遏蛋白 D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂

  34. 酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比

  35. 3.分解代谢物阻遏 • 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 • 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。

  36. 分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。 这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。

  37. 葡萄糖降解物与cAMP的关系 ATP 葡萄糖 降低cAMP浓度 腺苷酸环化酶 mRNAZ mRNAY mRNAa 抑制 基 因 表达 cAMP 分解代谢产物 cAMP 磷酸二酯酶 5'-AMP 激活 分解代谢物阻遏 CAP基因 CAP结合部位 结构基因 P O T LacY Laca R T LacZ RNA聚合酶 mRNA CAP cAMP -CAP 使CAP呈失活状态 CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）

  38. 三、提高酶产量的策略 • （一）菌种选育（一劳永逸） • 1.诱变育种 • (1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 • (2)使阻遏型变为去阻遏型 • 选育营养缺陷型突变株 • 解除反馈阻遏 • 选育结构类似物抗性突变株 • 解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株 • 2. 基因工程育种

  39. （二）条件控制 1. 添加诱导物 酶的底物类似物最有效。 2. 降低阻遏物浓度 除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP

  40. 3.添加表面活性剂 离子型 对细胞有毒害作用 表面活性剂 Tween－80 非离子型 增加细胞通透性 TritonX－100 4. 添加产酶促进剂

  41. 第二节 酶发酵动力学 一、细胞生长动力学 在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。

  42. 细胞生长曲线 O-A 延迟期A-B指数生长期B-C减速期C-D 静止期D-E 衰亡期

  43. 营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型 • µ:比生长速率（1/h） （specific growth rate） • µmax：最大比生长速率（1/h） • S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L • Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L

  44. 二、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即： 同步合成型 生长偶联型—— 中期合成型 部分生长偶联型——延续合成型 非生长偶联型 ——滞后合成型

  45. 1. 生长偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞生长同步。 特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。

  46. 生长偶联型中的特殊形式——中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。 枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线

  47. 2.部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线

  48. 3. 非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。 黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线

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