细胞增殖和凋亡异常与疾病

1. 细胞增殖和凋亡异常与疾病 广东药学院古宏标

2. 细胞周期

3. 分裂间期 前期 中期 有丝分裂

4. 中期 后期 末期 细胞质分裂 有丝分裂

5. 人体细胞分类 • 周期性细胞：它能连续按 G1 → S → G2 → M 四个阶段循环进行分裂，体内具有代表性的细胞：表皮细胞、骨髓干细胞、生殖细胞。 • G0 细胞：这种细胞暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激后可返回细胞周期，进行细胞增殖。例如，肝细胞、肾细胞。 • 终端分化细胞：细胞永远脱离细胞周期丧失分裂能力。例如，神经细胞、心肌细胞等。

6. 细胞周期分期和特点 • 单向性：细胞周期只沿 G1 → S → G2 → M 方向推进，不能逆行。 • 阶段性：细胞可因某种原因在某时相停滞，当条件适宜时，细胞又可重新活跃到下一时期。 • 检查点：增殖细胞在分裂过程中，为了保证 DNA 复制和染色体分配质量，细胞内存在监控机制 —检测点。各时相交叉处存在检查点（ check point ），只有通过检查点的检查，细胞才能进入下一个时相。 • 微环境影响：细胞外信号、条件也能决定细胞周期是否顺利推进。

7. 细胞周期自身调控 • CDK 在细胞周期中起到关键作用，它的活性高低决定细胞周期是否顺利进行 • cyclin 可以带动 CDK 磷酸化和去磷酸化， CDK 的磷 酸化（激活），可以推动细胞周期进行 • CDK 活化激酶（CAK）也参与 CDK 的磷酸化， CAK 是 CDK pathway 的上游信号分子 • CDK 抑制因子（ cyclin dependent kinase inhibitor, CDI ）是 CDK 的抑制物：可以与 cyclin/CDK 结合从而抑制 CDK 的活性，使细胞周期停止 • Rb 、 P53 、 c-myc 等也参与对 CDK 的活性调控

8. CDK活化激酶 （CDK activation kinase CAK） 周期素依赖性蛋白激酶 Cyclin dependent kinase, CDKs 周期蛋白（Cyclin） CDK抑制因子（ P21wafl、 P27kipl和 P15ink4b） Cyclin dependent kinase inhibitor, CDI 细胞周期相关调节因子

9. CDKs CDKs Cyclin Cyclin CDI CDKs Cyclin ＋ CDI 活化型 激活 失活型 CAK P 细胞周期的自身调控

10. B E D G0 G1 S G2 M 不同时相Cyclin的表达

11. B E D G0 G1 S G2 M 不同时相Cyclin的表达 DNA损伤检查点 DNA复制检查点 纺锤体组装检查点 探测器 传感器 检查点的结构 效应器

12. 细胞外信号对细胞的周期的调控 在细胞周期中，在 G1 期存在一个“限定点”（ restriction point ），它决定细胞是否进入周期。这“限定点”主要受细胞外信号的调控。 例如，当细胞外生长因子存在时，通过直接或间接信号使 cyclin D 表达增加。 cyclin D 再与 CDK4/6 形成复合物，并导致 pRb 高磷酸化，并释放出 E2F 转录因子。 E2F 激活 DNA 合成基因，细胞进入 S 期，这样细胞通过“限定点”。相反，转化生长因子β（ TGF- β）可以下调 cyclin 和 CDK4 的表达和促进 P21wafl、 P27kipl和 P15ink4b等 CDI 产生，使细胞阻滞在 G1 期。另外，如果此时细胞的微环境生长不利于细胞增殖的话，也可以通过 P16INK4a和 P15INK4b增加，抑制 Cyclin D-CDK4/6 复合物功能，使细胞阻滞 G1 期

13. cyclins 的异常表达增加 CDK 增多 CDI 表达不足和突变 检查点功能障碍 细胞过度增殖 肿瘤 细胞周期调控异常与疾病

14. 肾小球P27过表达 pRb低磷酸化 细胞增殖缺陷 糖尿病肾病 细胞周期调控异常与疾病

15. 约翰·苏尔斯顿 罗伯特·霍维茨 悉尼·布雷诺尔 2002年诺贝尔生理与医学奖获得者 细胞凋亡异常与疾病

16. 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的 细胞死亡过程 凋亡与坏死的形态比较

17. 细胞凋亡与坏死的区别★ 坏死 凋亡 ——————————————————— ——————————————————— 1.性质 病理性，非特异性 生理性或病理性，特异性 2.诱导因素 强烈刺激，随机发生 较弱刺激，非随机发生 3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成，不耗能 主动过程，有新蛋白合成，耗能 4.形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩 6.炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应 5.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一DNA片状 DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带 7.凋亡小体 无 有 8.基因调控 无 有 ———————————————————

22. 内源性核酸 内切酶 N个核小体 核小体 N个200bp 梯状电泳图谱

25. 凋亡过程 射线 高温 TNF 诱导 核酸内切酶、Caspases 效应期 结构解体 细胞死亡 降解期

26. 凋亡信号 • 生理性凋亡信号：激素 细胞因子的作用 • 糖皮质激素－－淋巴细胞凋亡 • 病理性凋亡信号：激素 细胞因子的作用 • 氧化应激－－自由基 活性氧 • 死亡受体－－Fas DR TNFR1 • 线粒体－－跨膜电位下降 释放内容物

27. FasL 内源性核酸 内切酶 Fas ICE 神经鞘磷脂 H1组蛋白 神经酰胺 Ca 2＋ DNA舒展 Caspase8 Caspase3、6、7 Bid 线粒体 Cyto-C 死亡受体介导的凋亡通路

28. 线粒体介导的凋亡通路 线粒体跨膜电位↓ 线粒体PTP开放 Cyt.C,Apaf,等释放 凋亡诱导因素 线粒体损伤 AIF 激活Caspases 活化Dnase 潜在Dnase 细胞凋亡 PTP：通透性转换孔 Apaf：凋亡蛋白酶激活因子 Cyt.C：细胞色素C AIF：凋亡诱导因子

29. 3．线粒体途径（Intrinsic or mitochondrial pathway） Ca2+ NO 缺血 缺氧 活性氧 MPT开放 + Apaf-1 Cyt.c Cyt.c Cyt.c ATP 膜通透性↑、线粒体肿胀、△m↓ AIF apoptosome Apaf-1活化 Apaf-1活化 CARD caspase-independent apoptosis + Pro-caspase-9 凋亡 Caspase-9 Pro-Caspase-3 Caspase-3 细胞凋亡异常

30. 细胞凋亡异常 4．Activation of caspase-3（共同通路）(Effector caspase) Pro-caspase-3 caspase-9 Caspase-3 Pro-caspase-9 Pro-caspase-6 Caspase-6 剪切细胞内结构蛋白 caspase-7 Pro-caspase-7 Pro-caspase-2 caspase-2 CAD（ caspase活化DNA酶） ICAD （抑制性 CAD） 细胞凋亡 CAD进入细胞核内降解DNA Caspases 激活的脱氧核糖核酸酶

31. 一、BcL-2族分子 抑制凋亡基因 BcL-2:bcL-2基因是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一,其表达的蛋白质BcL-2蛋白最初发现于B-淋巴细胞瘤/白血病-2（B cell lymphoma/Leukemia-2,BcL-2)而得名，与线虫ced9基因表达的Ced-9分子在结构上有同源性，具有抗凋亡作用。BcL-2的高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引发的细胞凋亡。如γ-射线、糖皮质激素、热休克、多种化疗药物。

32. BcL-2抗凋亡机制： • 直接抗氧化 • 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质 • 抑制凋亡调节蛋白的细胞毒作用 • 抑制凋亡蛋白酶的激活 • 维持细胞钙稳态

33. 促进凋亡基因 P53基因 • wtP53 • ——修复受损的DNA，如修复失败则诱导细胞凋亡 分子警察 P53蛋白 射线，毒素 + 细胞凋亡 • 突变的P53 丧失监视DNA损伤的功能 失活的P53

34. 双向调控基因 • C-myc： C-myc是一种癌基因，是调控细胞周期的主要基因。编码 的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录，在GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。 • Bcl-x ：是1933年发现的一类与Bcl-2相关基因；Bcl-xl——抑制细胞凋亡； Bcl-xs——促进细胞凋亡 。 。 。

35. 凋亡与疾病 细胞凋亡与疾病的关系——该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。 • 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病， • 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染 • 不足与过度并存：动脉粥样硬化

36. ㈡ 细胞凋亡过度 ⒈ 心血管疾病 ⑴ 心力衰竭 ⑵ 心肌缺血与再灌注损伤 ———坏死与凋亡共存 发生机制：氧化应激；细胞内钙超载； Fas受体上调；p53基因转录增强 凋亡特点：①早期凋亡为主，晚期坏死为主 ②梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 ③慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重 度缺血则常常发生坏死 ④IR引起的细胞凋亡有时比单纯缺血更严重

37. ⒉神经元退行性疾病 ———特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer disease AD） AD主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见β-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结 机制： β-淀粉样蛋白基因位于21号染色体，当钙超载、氧化应激或神经生长因子分泌不足时， Ca2＋内流增加，激活与β-淀粉样蛋白合成有关的基因，使β-淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激活周围的Mφ释放细胞因子和炎性介质促进凋亡的发生

38. ⒊病毒感染 • 病毒感染宿主细胞后有两种结局： • 一是诱导细胞 凋亡从而限制病毒生长（肝炎病毒）； • 二是由病毒基因表达的蛋白抑制宿主细胞凋亡，造成持续性感染或增加某些病毒的致癌可能性。 • AIDS:由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞被破坏，导致CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。 CD4+淋巴细胞与HIV感染者病情发生发展有密切关系，它决定感染者是否发病和发病的速度和严重程度。

39. HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素：HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素： 1）HIV的基因产物GP120能直接启动CD4+淋巴细胞的死亡程序 2）合胞体形成： 3）Fas基因表达上调 4）T细胞激活 : 激活诱导的细胞死亡 5）细胞因子: 受感染的Mφ释放TNF增多 6）tat蛋白:诱导CD4+淋巴细胞产生OFR，增强Fas表达 7）慢性感染时，受感染CD4+淋巴细胞作为效应细胞，可增强未感染的CD4+淋巴细胞对凋亡的敏感性

40. ㈢ 细胞凋亡不足与过度并存 由于细胞类型的差异，各种细胞在致病因子作用下，有些可表现为凋亡不足，而另一些细胞可表现为凋亡过度，因此同一疾病或病理过程中两种情况也可同时存在。 例如：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）

41. 细胞凋亡异常 ►细胞凋亡的发生机制（Mechanism of apoptosis） 1．氧化损伤（Oxidation damage ） 氧自由基破坏了机体正常的氧化/还原动态平衡，造成生物大 分子的氧化损伤，形成严重的氧化应激状态。 【Mechanism】 激活p53基因、消耗ATP、生物膜脂质过氧化、激活核酸内 切酶,启动细胞凋亡。 各种氧化剂、缺氧等直接通过氧化损伤诱导细胞凋亡。 2．钙超载（Calcium overload） 3．线粒体损伤（ Mitochondria damage ）

42. 细胞凋亡异常 钙超载引起凋亡机制 TNF-α、抗CD3抗体、TCDD等 胞浆[Ca2+] ↑ ■激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链； ■激活谷氨酰胺转移酶，促使细胞骨架分子之间发生广泛交联，有利 于凋亡小体形成； ■激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录； ■在ATP参与下，暴露出核小体之间的连接区，有利于DNA内切酶切 割DNA。 细胞凋亡

43. 表 细胞凋亡的调控基因 功能 基因 抑制凋亡基因 Bcl-2 Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等 促凋亡基因 P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、 Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等 双向调控基因 c-myc、Bclx 细胞凋亡异常 ►细胞凋亡的调控机制 （Regulated mechanism of apoptosis） 【调控基因】

44. 细胞凋亡异常 1．Bcl-2基因家族（Bcl-2 Family & regulating functions） Bcl-2 Apaf-1 Cyt.c Cyt.c Cyt.c MPT开放 + ATP 膜通透性↑、线粒体肿胀、△m↓ Apaf-1活化 Apaf-1活化 AIF Caspase抑制剂 apoptosome CARD caspase-independent apoptosis + Pro-caspase-9 Caspase-9 凋亡 Pro-Caspase-3 Caspase-3 ■ Bcl-2（Bcl-XL）能够抑制线粒体MPT开放，Cyt.c 、AIF释放↓ ■ Bcl-2能够结合和灭活Apaf-1，阻断对caspase-9活化 ■Bcl-2也能特异地结合细胞色素C

45. 细胞凋亡异常 2．p53基因（抑癌基因） As a transcription factor, p53 regulates downstream genes important in cell cycle arrest, DNA repair, and apoptosis. After DNA damage, p53 holds the cell at a checkpoint until the damage is repaired. If the damage is irreversible, apoptosis is triggered. 【促凋亡机制】 ■P53通过与Bcl-2基因相互作用，下调Bcl-2的表达。 ■P53诱导细胞凋亡的靶蛋白表达（线粒体和死亡受体介导）。 ■P53诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（Bax、NOXA、 PUMA）表 达，并触发细胞色素C释放和caspase活化。 ■P53诱导死亡受体Fas表达。 ■P53能使死亡受体再定位于细胞膜上。

46. 三、细胞凋亡异常和疾病 （Diseases associated to apoptosis deregulation） 表： 与细胞凋亡异常相关的疾病 凋亡不足 凋亡过度 肿瘤 肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌 发育异常 气管-食管瘘、房（室）间隙缺 、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前 损、唇（腭）裂、短肢畸形、 列腺癌等 尿道下裂以及多囊肾等 发育异常 先天性消化道、胆道、肛门狭 CNS Alsheimer病、Parkinson 病、 窄或闭锁、动脉导管未闭、两 肌萎缩性侧索硬化症、色素性 性畸形、甲状舌骨囊肿等 视网膜病，脊肌肉萎缩、早老 免疫系统 系统性红斑狼疮、糖尿病、类 性痴呆 风湿性关节炎、桥本甲状腺炎 免疫系统 免疫缺陷病、AIDS 、多发性的硬化症等 细胞凋亡异常

47. 虽然过去数十年，研究工作者发现了细胞凋亡的重要机制，但是在实验中，人们也能发现一些奇怪的现象，如非凋亡的程序性死亡。经典的理论认为，细胞凋亡是程序化的，而细胞坏死则是突发性的，被动的。本周Nature Chemical Biology, 上刊登了华人袁钧英教授及其同事的新的发现，通过体外以及小鼠的脑缺血的体内模型均观察到一种非凋亡的程序性死亡的新现象。 (1) Cell 1993 (H Robert Horvitz) (2) Cell 1993 (3) Science 1994 (4) Cell 1994 (5) Nature 1997 (6) Cell 1998 (7) Cell 1998 (8) Cell 1999 (9) Nature 2000 (10) Nature Cell Biol  2001 (11) Nature 2003 (12) Cell 2003 (13) Cell 2004 (14) Nat Chem Biol 2005 (15) Cell 2005 (16) Science 2005 (17) Nat Cell Biol 2007 袁钧英及其同事筛选了大约15000种化合物，发现了这种小分子能抑制这种特殊形式的细胞死亡。命名为necrostatin-1或Nec-1，能抑制TNF诱导的细胞坏死。这也是第一次提供另一种细胞程序性死亡的有力证据。Faden告诉记者，“看样子这是一条新的途径，这是极其优秀的发现”。 袁钧英认为，这种非凋亡性程序性死亡在中风病人身上会有发生，新的Nec-1有望抑制这种现象的发生，从而为将来研究相关的药物，甚至临床应用提供有力的证据。不过Shaham认为这条新的途径并非与经典的途径毫无关系，而认为它们可能同相互作用，共同导致细胞损伤。 袁钧英 Yuan J. 

48. 领导这一研究的是华人女科学家袁钧英博士，其一直从事细胞死亡的相关研究，2005年她发现了一种细胞非调亡性的程序性死亡，英文称为necroptosis，文章发表在Nature Chemical Biology，并获得了美国卫生研究所（NIH）颁发了最新的NIH主任先驱奖（Director‘s Pioneer Award）。 自体吞噬（autophagy）指细胞将自己细胞质的一部分（如线粒体和内质网）包围起来形成液泡（自体吞噬泡），再依靠初级溶酶体供应的水解酶将其消化，可由于饥饿和激素的作用等诱导产生。 1. Cell 1994 (Goldstein JL and Brown MS) 2. Cell 1996 (cytochrome c) 3. Science 1997 4. Cell 1997 5. Cell 1997 Apaf-1 6. Cell 1997 Apaf-1/caspase-9 complex 7. Cell 1998 8. Nature Cell Biol 1999 9. Cell 2000 10. Nature Cell Biol 2000 11. Nature 2001 12. Science 2003 13.Cell 2004 14.Cell 2005 自体吞噬活性的降低会导致神经细胞中错误折叠蛋白的积累，并且也许在慢性神经退行性疾病，比如亨廷顿舞蹈病（Huntington's disease，HD，是一种由IT15基因上CAG重复序列异常扩展所致常染色体显性遗传的神经退行性疾病），阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD，即老年痴呆症）中也会出现。 为了探究自体吞噬的机制，以及识别出激活自体吞噬的小分子，在这一研究中，研究人员对自体吞噬的小分子调控子进行了一系列的高通量，以成像为基础的筛选。通过这一筛选研究人员就可以区分开真正导致自体吞噬减少的复合物，以及由细胞损伤或阻碍下游溶酶体功能引起的自体吞噬泡（autophagosomes）积累的复合物。 从中研究人员分辩出了8种复合物会引起自体吞噬，促进长期存在的蛋白的降解。有趣的是，其中7种是FDA批准的，用于人类疾病治疗的药物，而且研究人员也发现这些复合物会减少培养细胞中扩充性多聚谷氨酸（polyglutamine repeat）水平。因此这些药物可能可以用于亨廷顿舞蹈病，以及其它带有错误折叠蛋白积累症状的人类疾病的治疗。 王晓东 Wang XD