课件说明 本课件是为本院的细胞生物学教学制作的，适用于生物科学、生物技术专业的本科生实验教学。

1. 课件说明 　　　本课件是为本院的细胞生物学教学制作的，适用于生物科学、生物技术专业的本科生实验教学。 　　　本课件结合实验条件与学生的实际情况，内容包括一些常用的细胞生物学基本实验，如特殊显微镜的使用、显微摄影技术、细胞化学技术、细胞组分的分级分离、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、细胞生理活动等。课件除对实验原理、过程作简明的文字阐述外，还包含相当的图表，使学生直观地了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法。 　　　本课件的使用有助于培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。

2. 细胞生物学实验

3. 常用实验动物的了解和解剖器械的使用 一、常用实验动物 细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。 蟾蜍 蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。 1．雌雄鉴别 通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。 2．捉拿及处死方法： 常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。

4. 小白鼠 小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。 1．捉拿方法： 将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。 2．处死方法： 处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。

5. 小鼠的脱臼处死法

6. 3．给药方法： 小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。

7. 二、常用手术器械及操作方法： 1．解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。 2．解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。 3．大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。 4．眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。 5．眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。 6．钝头镊子：用于提取脏器、组织等。 7．有钩镊子：用于提取皮肤切口等。

8. 细胞生物学实验绘图方法与要求 (一) 生物绘图的要求 • 具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。 • 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。 • 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。 • 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。 • 绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 • 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。

9. (二) 生物绘图的方法 点点衬阴法:将图形画出后，用铅笔点出圆点，以表示明暗和深浅，给予立体感。在暗处点要密，明处要疏，但要求点要均匀，点点要从明处点起，一行行交互着点，物体上的斑纹描出再点点衬阴，点点衬阴法要求不能用涂抹阴影的方法以代替点点，此点初学者要尤为注意。 轮廓图（左）和细胞图（右）

10. 实验一 普通光学显微镜的结构及其使用 [目的要求] 1、掌握普通光学显微镜的主要构造及其性能; 2、掌握低、高倍镜的正规使用方法，反复练习，观察时保持两眼同时睁开和两手并用。 [实验用品] 光学显微镜、各种动植物玻片标本。

11. [实验内容和方法] 一、光学显微镜的主要构造 主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分 (一) 机械部分 1.镜座 2.镜柱 3.镜臂 4.镜筒 5.调节器 6.物镜转换器(旋转盘) 7.载物台 (二)照明部分 1．集光器 :(1)集光镜 (2)虹彩光圈 2．反光镜

12. (三)光学部分 1．目镜 常备有2—3个目镜，上面刻有5x、10 x、15×等符号以示其放大倍数，可选择使用，一般常用的目镜倍数为10 x。 2．物镜 主要性能指标——放大倍数和镜口率(如10／0.25、40／0.65和100／1.25)，镜筒长度和所要求的盖玻片厚度(如160／0.17)。

13. 二、显微镜的使用方法 显微镜在使用前，应先检查一下它的各个部件是否 完整和正常，并进行必要的清洁工作，然后将显微镜放置 在自己左肩前方的实验台上，离桌子边缘3—6cm为宜，以 便观察。 (一)低倍镜的使用方法 1．对光 2．放置玻片标本 3．调节焦距 (二)高倍镜的使用方法 1.一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，再把需要放大的部分移至视野正中，并把物像调节到最清晰的程度。 2．转动物镜转换器

14. (三)油镜的使用方法 1.在高倍镜下找到所要观察的标本移至视野中心。 2.把集光器上升到最高位置，光阑开到最大。 3.移开高倍镜，在要观察的部位的盖玻片上滴加一滴香柏油作为介质。 4．稍稍上升镜筒或下降载物台，使油镜对准通光孔，慢慢转动粗调螺旋，使油镜与油滴接触，再小心地使它贴近盖玻片表面。 5．用眼观察目镜，微微上升或下降载物台，直到出现清晰的物像。 6．油镜使用完毕，先用拭镜纸蘸少许二甲苯将镜头上的大部分油去掉，再用干拭镜纸擦拭。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。 四、操作练习

15. 『思考题』 一、在调焦操作时，为什么低倍镜要先调到距标本片表面＜6mm处，油镜一定要贴近标本片表面？如果把标本片放反了，将会出现什么问题？为什么？ 二、在低倍镜调节焦距时。当视野中出现了能随标本片移动而移动的颗粒或斑纹。是否只要调节推进器将标本对准物镜中央，就一定能观察到标本的物像?为什么? 三、你如何分析判断视野中所见到的污物点是在目镜上? 四、使用显微镜观察标本，为什么—定要从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进行? 五、在转动细调螺旋时，如已达极限转不动时，你应如何解决?

16. 实验二、几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用实验二、几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用 『目的要求』 了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜的工作原理、构造和使用方法。 『实验用品』 暗视野显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、荧光显微镜（透射式和落射式）、黑纸片、剪刀、圆规、无荧光镜油、培养的活细胞、丫啶橙染色玻片标本、活细胞临时装片（盐藻）。

17. 『实验内容和方法』 一、暗视野显微镜 (一)   原理和结构特点 原理:利用光学上的丁达尔现象设计的。 结构特点:中央遮光板或暗视野聚光器，从而使光线改 变途径，倾斜地照射在观察的标本上，照明光线在聚光 器顶透镜（或盖片）的上表面发生全反射，因而背景是 暗的。标本被斜射光照射发生反射或散射，在黑暗的背 景下呈现明亮的像。只能看到物体的存在和运动，不能 辨清物体的细微结构。可分辨0.004um以上的微粒的存 在和运动，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运 动等。

18. （三）使用方法 1．装暗视野聚光器。 2．选用强的光源，一般用显微镜灯照明。 3．在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油。 4．升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。 5．以下操作方法同普通显微镜。 （四）观察

19. 二、相差显微镜 (一)  原理和结构特点 原理：相差显微镜能够改变直 射光或衍射光的相位，并且利用 光的衍射和干涉现象，把相差变 成振幅差(明暗差)，可用以观察 活细胞或未染色标本。 结构特点：用环状光阑代替可变 光阑，用带相板的物镜(通常标 有Ph的标记)代替普通物镜，并 带有一个合轴用的望远镜。

20. (二)使用方法 1．相差装置的调换安装 将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，换上相差物镜。 2．调焦 3．合铀调整 (三)观察 观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构。

21. 用途：观察活细胞和未经染色的玻片标本

22. 三、荧光显微镜 (一)原理和结构特点 原理：利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统 发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作 为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜 色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。 按光路分两种： 1．透射式荧光显微镜 2．落射式荧光显微镜

24. （二）使用方法 1．打开灯源，预热几分钟。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3．用低倍镜观察，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 4．放置标本片，调焦后即可观察。 (三)观察 用蓝紫光滤光片，可见经0.01％的丫啶橙荧光染料染 色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的 荧光(暗绿色和橙红色)。

25. 荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色）

26. 四、倒置显微镜 光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，主要 差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜 装在标本的下方，因此可以用来观察生长在培养皿 底部的细胞状态。它与相差装置配合，可以用来观 察培养的活细胞。 [作业] 一、比较四种特殊的光学显微镜。 二、为什么说倒置相按显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜? 三、荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用? 四、描述在特殊光镜观察到的盐藻形态。

27. 实验三、显微摄影技术 『目的要求』： 掌握显微摄影原理、装置及其操作技术，能独立完成全过程 『实验用品』: 复式光学显微镜、摄影装置、各色滤光镜、胶片、显影罐、黑白放大机、暗室袋、暗盒、定时器、标本玻片、显影及定影液

28. 『实验内容和方法』 一、显微摄影装置 专用摄影目镜，再装上一个无镜头相机，测光系统—可提供感光量参考值；自动控制感光装置—似“傻瓜”相机，以图像亮度自动设定感光时间，并据此开启快门曝光。 二、胶片的选择 高分辨力、大反差、色饱和度高而颗粒细，感光灵敏度低。 胶片的照相性能： 感光度；反差系数；宽容度；解像力；标准倒易率失效补偿值

29. 三、显微摄影的一般步骤 （一）拍摄前准备工作 1、显微镜的光路合轴：聚光器的调中 ，光源调中 2、选用合适的物镜和目镜； 3、合理调节孔径光阑的开度； 4、加用滤色镜 （二）装入胶片：同普通相机 （三）取景和聚焦 （1）屈光度调节： （2）取景： （3）聚焦： （四）曝光：

30. 显微摄影拍摄的曲细精管横切面　（精细胞的不同发育阶段）显微摄影拍摄的曲细精管横切面　（精细胞的不同发育阶段）

31. 『思考题』 一、显微摄影为什么特别强调提高影像的反差，如何提高？ 二、取景聚焦时，为什么要进行屈光度调节？ 三、什么是倒易率失效？显微摄影时如何对待它？ 四、你认为要得到一张较好的显微摄影照片，应注意那些方面的问题，主要关键是什么？

32. 实验四、DNA的原位显示—Feulgen染色法 『目的要求』 1、掌握Feulgen反应的基本原理 2、掌握Feulgen反应操作全过程。 3、熟悉细胞化学技术 『实验用品』 光学显微镜、恒温水浴锅、染色缸、小烧杯、滴管、载玻片、Schiff试剂、1N的HCL溶液、3%的亚硫酸氢钠溶液，4.5%的醋酸、洋葱根尖

33. 『实验原理』 DNA经弱酸（1N的HCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧 核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛 基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸 溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA 的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应 产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具 有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提 去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen 反应的专一性。

34. 『实验内容和方法』 （一）Feulgen反应的一般步骤： 1、取一小段洋葱根尖于小烧杯中，用1N盐酸60℃水浴中水解8min。 2、去盐酸，用蒸馏水漂洗片刻。 3、Schiff液染色30min。 4、用新配制的亚硫酸氢钠溶液洗3次，每次约5min，直至出现红色 5、用自来水洗5min。 6、滴一滴4.5%醋酸于载玻片，将根尖放于载玻片的醋酸中，加盖玻片，轻压。 7、镜检：细胞内DNA的部位呈紫红色。

35. 『思考题』 一、简述Feulgen反应的原理。 二、欲得到一张好的Feulgen反应制片，制片过程中应注意些什么？

36. 实验五、细胞内过氧化物酶的显示 『目的要求』 1、掌握原位显示细胞内某种酶的原理。 2、掌握原位显示细胞内某种酶操作过程。 『实验用品』 光学显微镜、解剖盘、染色缸、微量注射器、解剖器械、0.5%CuSO4、 0.2%联苯胺、1%番红、3%H2O2溶液、小白鼠、马铃薯

37. 『实验原理』 细胞内存在的过氧化物酶能把许多胺类氧化成 有色化合物，联苯胺可被细胞内的过氧化物酶氧化 成蓝色或棕色产物（蓝色物质为中间产物联苯胺 蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙）， 因而显示出细胞内过氧化物酶的分布。另外细胞代 谢过程会产生对机体有害的过氧化氢（H2O2），过 氧化物酶使其分解成水，对机体起保护作用。通过 植物块茎与过氧化氢相遇后所发生的反应间接证实 酶的存在。

38. 『实验内容和方法』 （一）小白鼠骨髓细胞过氧化物酶的显示 1、取材：处死小白鼠取股骨，剪断两头，用微量注射器吹出骨髓细胞于载玻片上，涂片，晾干。 2、固定：将涂片放入0.5%硫酸铜染缸中固定30S—1min。 3、氧化：取出涂片直接转入0.2%联苯胺染缸中氧化3—6min。 4、冲洗：蒸馏水或自来水冲洗。 5、染色：滴1、2滴1%番红溶液于涂片上，染色1min。 6、冲洗：蒸馏水或自来水冲洗，晾干。 7、镜检：可见骨髓细胞内有被染成蓝色或棕色的颗粒，就是过氧化物酶的部位。

39. （二）植物细胞内过氧化物酶的间接显示 1、徒手切片：取马铃薯以徒手切片法切取小薄片于载玻片上。 2、滴加3%的过氧化氢溶液于载玻片上，可见组织周围出现大量的气泡，提示植物细胞中存在过氧化物酶。 『思考题』 一、过氧化物酶显示方法的实验原理是什么？

40. 实验六、细胞融合 『目的要求』 1、了解细胞融合的原理。 2、掌握细胞融合的实验方法 『实验用品』 血球计数板、水浴锅、离心机、光学显微镜、载玻片、Alsever溶液、50%PEG溶液、酶液（消化细胞壁）、13%CPW洗液、20％蔗糖溶液、GNK液、生理盐水、Janus greenB染液、鸡血红细胞

41. 『实验原理』 在某些诱导物（如仙台病毒、聚乙二醇等）的诱导下，使亲本细胞膜发生一定的变化，能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，一些正极化集团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2＋等阳离子。Ca2＋可在一些负极化基才和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

42. 灭活的病毒介导细胞融合

43. 『实验内容和方法』 一、植物原生质体的融合 1、原生质体的分离 将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解1～2小时。过滤除去未完全消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心2分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20％蔗糖溶液上（5ml离心管装3ml20％蔗糖溶液），在1000rpm条件下离心5～10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体悬浮在20％蔗糖溶液与13％CPW溶液之间，破碎的细胞残渣沉于管底。 用200l的移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加入4ml13％CPW洗液，1000rpm离心2分钟，弃上清，用血球计数板调整原生质体密度为105－106之间。

44. 2、原生质体融合 将1～2滴原生质体混和物（密度为105－106之间）滴入小培养皿（或载玻片上），静置8～10钟，相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1ml和2ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、第三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能洗干，否则原生质体破碎死亡。最后用培养基洗1～2次即可进行培养。 3、观察

45. 二、动物细胞的融合 1、鸡红细胞悬液（1：4的悬液）的制备。 2、洗涤：1200r /min离心5min，去上清，再以上述条件离心洗涤两次。 3、将沉淀加入2-3 ml GKN液，混匀。 4、计数，稀释至每毫升1.5×106个。 5、悬液1 ml放入37℃（39℃左右更佳）预热。同时将50%PEG液预热。 6、待温度恒定后，在1ml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml50%PEG液，边加边摇匀，放入水浴锅中。 7、细胞融合20-30min后，加入GKN液至8 ml，静止于水浴锅中20min左右。 8、取出离心管，800r/min离心3min，使细胞完全沉降。去上清，加GKN液，再离心一次。 9、去上清，加少量GKN液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入Janus green染液，用牙签搅匀，3 min后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。

46. 『思考题』 一、细胞融合率受那些因素影响？ 二、在进行细胞融合时要注意那些问题？ 三、简述植物原生质体融合培养研究的实践意义。

47. 实验七 细胞凝集反应 『目的要求』 1、掌握细胞凝集反应的原理。 2、掌握细胞凝集的实验方法 『实验用品』 光学显微镜、离心机、载玻片、生理盐水、PBS液、Alsever液、土豆块茎、韭菜叶子、兔血红细胞

48. 『实验原理』 细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。 凝集素是一类含糖并能与糖专一结合的蛋白质，被认为其与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂调控有关。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 大多数凝集素存在于储藏器官内，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。凝集素与糖的结合活性以及专一性决定其功能。

49. 『实验内容和方法』 一、2%兔血红细胞制备： 二、土豆块茎： 1、提取凝集素：称取土豆去皮块茎4g，加少许磷酸缓冲液研磨成匀浆，最终加到30ml磷酸缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液含有可溶性土豆凝集素。 2、测定血凝活性： 3、用磷酸缓冲液作为对照。

50. 三、韭菜叶片： 1、取3-5 g韭菜叶片，按1：1（W/V）加入生理盐水，用捣碎机或研磨成匀浆，过滤，滤液在5000r/min下离心20min，收集沉淀，用磷酸缓冲液5ml溶解。 2、加硫酸胺（约1.8g）至60%饱和度沉淀，5000r/min下离心20min，沉淀用1ml磷酸缓冲液溶解。 3、测定血凝活性： 4、用磷酸缓冲液作为对照。 『思考题』 一、那些因素影响细胞凝集反应？