Transcription

1. Transcription

2. Transcription • การถ่ายทอดข้อมูลพันธุกรรม (genetic information) จาก DNA (double-stranded) ให้ไปอยู่ในรูปของ RNA (single-stranded หรือเป็น • กระบวนการสร้างสำเนา (copy) RNA ของ gene หรือเป็นกระบวนการ RNA Synthesis

3. Link ระหว่าง Transcription & Translation

4. หัวข้อ ~ Transcription 1. Factors ของ transcription 2. Direction ของ transcription 3. Mechanism ของ transcription 4. Control ของ transcription ใน Prokaryotic cells 5. Control ของ transcription ใน Eukaryotic cells 6. Mechanism ของ RNA splicing 7. Reverse transcription

5. Factors สำคัญใน Transcription 1. DNA template 2. RNA polymerase 3. Promoter 4. Terminator

6. 1. DNA template • ใช้เพียง 1 strand เรียกว่า Template strand • Strand ตรงข้าม เรียกว่า Nontemplate strand • RNA จะเหมือน nontemplate ยกเว้น U แทน T • กรณี mRNA จะเรียกว่า Sense strand ซึ่ง base ตรงกับ nontemplate strand • จึงใช้ลำดับ base ของ strand นี้เขียนเป็นลำดับ base ของ gene

7. Template and Nontemplate strands

8. ส่วนสำคัญของ DNA Template สำหรับ Transcription • Gene ใดๆบน DNA ที่จะถูก transcribed ต้องมี 3 ส่วนสำคัญตามลำดับคือ promoter…….…..structural gene……….terminator

9. Promoter • เป็น sequence พิเศษบน DNA สำหรับให้ RNA polymerase จับก่อนเริ่มสังเคราะห์ RNA • promoter อยู่ก่อน startpoint (+ 1) ของ structural gene จึงให้หมายเลขของ nucleotide ของ promoter เป็น ลบ (-) • Terminator sequence • เป็น sequence พิเศษบน DNA หรือสุดท้ายของ gene สำหรับหยุด Transcription

10. 2. RNA polymerase • เป็นเอนไซม์ที่ประกอบด้วยหลายหน่วย รวมเรียกทั้งโมเลกุลว่า Holoenzyme • ประกอบด้วย 2 components หลัก คือ • Sigma (s) factor สำหรับ เริ่มต้น transcription โดยเฉพาะเท่านั้น • Core polymerase สำหรับคลายเกียว DNA template และใส่ RNA nucleotides ตั้งแต่เริ่มจนหยุดtranscription

11. RNA polymerase มี 5 subunits คือ - 1 s (Sigma) subunit - 2 a (Alpha) subunits - 2 b (Beta) subunits

12. RNA polymerase ไม่สามารถทำหน้าที่ proofreading ความถูกต้องของ nucleotides ที่ใส่เข้าในกระบวนการ การไม่ proofreading ไม่วิกฤต เพราะ RNA มีอายุสั้น และ มีจำนวนหลาย copies และสร้างใหม่ได้เร็ว

13. 3. Promoter • เป็น regulatory sequence บน DNA โดยเป็น binding site ของ RNA polymerase เพื่อ start transcription • เป็น signal สำหรับ initiation และเลือกว่า DNA strand ใดจะถูก transcribed • Transcription จะประสบผลสำเร็จหรือไม่ขึ้นอยู่กับความสามารถของ promoter ในการจับกับ RNA polymerase แข็งแรงหรือไม่

14. Promoter เมื่อถูกจับด้วย RNA PolymeraseClosed promoter เป็นweak promoterOpened promoter เป็น strong promoter

15. 4. Terminator • เป็น sequence ให้ signal หยุด transcription • Terminator site เป็น inverted repeat sequence บน DNA template และ บน RNA ที่สร้างได้ • บน DNA form เป็นรูปกางเขน (Cruciform structure) • บน RNA form เป็น Stem-loop structure ก่อน base ตัวสุดท้ายจะถูก transcribed

16. Terminator sequencesบน DNA และบน RNA

17. Terminator เป็นที่จับของ protein พิเศษที่ใช้ในการหยุด transcription เช่น rho (r)หรือ NusA protein • RNA polymerase จำ terminator site ได้ ทำให้ RNA polymerase หลุดออก DNA template หยุด transcription ได้เองโดยไม่ต้องการ protein พิเศษ • RNA polymerase จำ termination site แต่ต้องการ protein พิเศษ ในการหยุด transcription

18. Direction ของ Transcription • RNA ที่สังเคราะห์ได้ยาว จาก 5’ ---> 3’ • โดย nucleotides โมเลกุลใหม่จะถูกนำไปต่อเข้าที่ 3’ ของ nucleotides ที่มีอยู่แล้ว

19. ในขณะเริ่มสังเคราะห์ RNA polymerase จับและ คลายเกลียว DNA บริเวณ Promoter ก่อนตำแหน่ง start point • DNA template ที่ถูกคลายเกลียว (unwind) และใช้เป็นแบบ แล้วจะทำเกลียวกลับคืน (rewind) ไล่ตาม RNA polymerase ไปเรื่อยๆ

20. Mechanism ของ Transcription 1. Initiation 2. Elongation 3. Termination

21. 1. Initiation of Transcription • ต้องการ Promoter และ RNA polymerase 1.1Promoter • เป็น sequences ก่อน start point กำหนดให้เป็น upstream ลบ (-) 1 นับถอยหลังไปทางซ้าย • Start point บน structural gene กำหนดให้เป็น downstream บวก (+) 1 และหลังจากจุดนี้นับทางขวาเป็นบวก

22. 1.2 RNA polymerase Holoenzyme เคลื่อนเข้ามาบน promoter ซึ่งเป็น Closed promoter sfactor ทำหน้าที่จำ promoter และจัดให้ core enzyme จับบน promoter ในตำแหน่งที่ถูกต้อง Core enzyme แยก DNA ออกเป็น Opened promoter พร้อมเคลื่อนที่ไปมาจน s factor อยู่ที่ start point Core enzyme ใส่ RNA nucleotide ตัวแรกที่ start point เมื่อเริ่มได้แล้ว s factor จะหลุดออกจาก promoter

23. Initiation of transcription

24. 2. Elongation of Transcription • Core ของ RNA polymerase ทำหน้าที่ต่อ RNA nucleotides เข้าที่ 3’ - OH ปลายอิสระของ nucleotide ที่มีก่อนแล้ว และ ต่อเข้าไปเรื่อยๆ ให้ได้ RNA สายยาวจาก 5’ ---> 3’ • RNA ที่ synthesis ได้ใหม่คงทำ complementary อยู่กับ DNA template • ส่วน RNA ช่วงที่ synthesis ได้ก่อนแล้วจะหลุดออกจาก template และ template พันเกลียวคืนเป็น DNA duplex

25. Elongation of transcriptionคงเหลือแต่ core enzyme ของ holoenzyme RNA polymerase ที่ทำหน้าที่สังเคราะห์ RNA ต่อไป

26. Termination of Transcription • RNA polymerase ทำงานมาถึง terminator จะหยุด transcription • Terminator มี 2 types คือ 1) Rho - dependent terminator 2) Rho - independent terminator • Terminator ทั้ง 2 types เหมือนกันคือ มี • inverted repeat sequence บน DNA และ RNA

27. 1) Rho-dependent terminator Rho [ r ] จับที่ RNA และ เคลื่อนที่ ไปบน RNA จนตาม ทัน RNA polymerase ที่ terminator ทำให้ RNA polymerase อ่าน ผ่าน terminator ไม่ได้ หยุด transcription ส่วนต่าง ๆ แยกออกจากกัน

28. 2) Rho-independent terminator หยุด transcription โดยไม่มี rho protein ที่ Terminator เพราะบน DNA มี base A มาก และ บน RNA มี base U มาก หลัง stem-loop ทำให้ได้การจับของ A-U base pairs ไม่ แข็งแรง จึง stable น้อย เป็นผลให้ RNA และ RNA polymerase หลุดออกจาก DNA และหยุดtranscription

29. RNA Script

30. RNA Script RNA ที่ transcribed ได้ใหม่ยาวกว่า gene ปกติ เพราะ RNA polymerase จะอ่านลอกแบบ gene ทุกส่วน ยกเว้น promoter RNA script ต้องถูกแปรรูป (processing) ก่อนทำงานได้จริง 1. 5’ leader segment จากส่วนต้นของ start point 2. Protein-coding sequence ของ gene 3. 3’ trailer segment จากส่วน terminator

32. Transcriptional Control in Prokaryote