Tumor growth

1. Tumor growth • Tumor is characterised by uncontrolled cell duplication • Tumor is clinically detectable when weights around 1 g about 109 cells • The tumor damages mechanically surrounding healthy tissue and organs • Tumor growth is described by its doubling time (volume)

2. Tumor growth and neovascularisation • The growth of tumor is associated to formation of blood vessels needed for oxygen and food (neoangiogenesis) • Rapidly growing tumors could have slower angiogenesis that leads to necrotic and hypoxic regions into tumors

3. Tumor growth: after RT, CT and OT • Tumor growth is stopped due to tumor’s cells death • Tumor volume diminuishes slowly because death cells are evacuated slowly Local control • “All” tumor’s cell are destroyed • Immunitary killing of few survival cells Growth delay • Proliferation stop (lag time) • Some tumor’s cell die • Volume reduction (clinical negativization) • Surviving fraction restart (recidiva)

4. Tumor cells proliferation Cell kinetics: • Proliferating cells • Quiescent cells (could proliferate but are at rest) • Steryle cells (could not proliferate) • Death cells (to be removed)

5. Cell cycle G1 S G2 M G1 or G0 Check points = fasi di arresto della progressione del ciclo con funzione di controllo della integrità cellulare Reclutamento = trasferimento dalla fase di quiescenza alla fase di proliferazione

6. Tumor growth parameters • Growth fraction • frazione della popolazione cellulare in attività proliferativa • Cell cycle duration (G1 to M) • tempo impiegato da ogni cellula per dividersi • Cell loss • frazione della popolazione cellulare che muore • Potential doubling time (Tpot) • tempo che il tumore impiegherebbe per raddoppiare il proprio volume in assenza di cell loss • Volume doubling time • tempo di raddoppio reale considerando anche la cell loss • Durata del ciclo = 2 giorni (15 h – 100 gg) • Growth fraction = 40% • Cell loss = 90% • Tpot = 5 gg • Volume doubling time = 70 gg

7. Fasi della interazione delle radiazioni ionizzanti con i sistemi biologici Fase chimica Effetto diretto • interazione diretta con molecole “biologiche” • rottura legami nella catena nucleotidica del DNA Effetto indiretto • interazione con le molecole di acqua presenti nella cellula • produzioni radicali liberi (ROS) • fissazione radicali su molecole biologiche • induzione rottura legami chimici • induzione legami anomali • alterazione della struttura della molecola • alterazione della funzione legata alla molecola danneggiata Produzione di modificazioni della struttura chimica delle specie molecolari del sistema biologico irradiato -3 10 sec

8. Fase chimica In presenza di O2 • HO2° • O2° • H2O2 Prodotti della radiolisi dell’acqua • ioni H 2O+ • e- • OH° • H° • Destino dei radicali liberi • inattivazione chimica per ricombinazione • inattivazione “scavenging” da parte di radicali SH • fissazione su molecole biologiche • alterazione molecole biologiche Molecole biologiche bersaglio Il danno della molecola del DNA è classicamente considerato l’evento chimico responsabile del danno che porta alla morte cellulare

9. Fase chimica Effetti sulla molecola del DNA Struttura del DNA • Macromolecola con struttura a doppia elica costituita da due filamenti fatti da una sequenza di nucleotidi ; ogni nucleotide è costituito da una base (Timina, Citosina, Adenina e Guanina), uno zucchero (desossiribosio) e un fosfato. Le basi sono legate fra loro dai gruppi zucchero-fosfato. I due filamenti configurati ad elica sono legati fra loro da legami idrogeno tra le basi (T-A e G-C). • Durante la fase di sintesi del ciclo cellulare (S) la cellula replica il proprio DNA. La trascrizione della struttura del DNA è effettuata attraverso un’altra macromolecola (RNA messaggero)

10. Fase chimica Effetti sulla molecola del DNA • La irradiazione può produrre vari tipi di alterazioni nella struttura della molecola del DNA per effetto diretto o indiretto • alterazioni delle basi pirimidiniche (T , C ) o puriniche (A , G ) • alterazioni del desossiribosio • rottura di legami con distacco di frammenti e formazione di nuovi legami nello stesso filamento o crociati • rottura di un singolo filamento dell’elica (Single Strand Break) • rottura di entrambi i filamenti (Double Strand Break) per effetto di una singola traccia o di due tracce contemporanee (hot spots)

11. Fase chimica Effetti del danno del DNA • Riparazione completa con restitutio • avviene per la grande maggioranza delle alterazioni minori • la cellula riprende la sua normale attività • Riparazione erronea (misrepair) • la cellula muore dopo alcune divisioni (morte mitotica ritardata) • la cellula muore senza dividersi per accelerazione della morte programmata (apoptosi) • la cellula non muore ma presenta mutazioni che possono modificare alcune funzioni • Fissazione non riparabile del danno • la cellula muore subito nel giro di ore per liberazione di enzimi litici indipendentemente dalla mitosi (morte interfasica); riguarda alcune specie cellulari specifiche (linfociti, ovociti, cell. salivari sierose) • la cellula muore in occasione del primo evento mitotico (morte mitotica) o dopo alcune mitosi (morte mitotica ritardata) Il danno non riparabile è sostanzialmente rappresentato dalle doppie rotture (DSB)

12. Fasi della interazione delle radiazioni ionizzanti con i sistemi biologici effetti biologici conseguenti alle alterazioni delle molecole biologiche Fase biologica • La manifestazione clinica (effetto clinicamente rilevabile) dell’effetto biologico delle radiazioni si verifica sempre ad una certa distanza dalla esposizione (tempo di latenza) • Si parla di effetti acuti per indicare gli effetti che si manifestano a distanza di giorni da una esposizione singola o nel corso di una irradiazione frazionata • Si parla di effetti tardivi per indicare gli effetti che si manifestano dopo mesi o anni dalla irradiazione • Alcuni tessuti rispondono con effetti acuti e con effetti tardivi • Altri manifestano solo effetti tardivi Alla conoscenza dei meccanismi della reazione tessutale alle radiazioni ha dato un impulso decisivo la biologia molecolare

13. Radiobiologia molecolare Patogenesi del danno da radiazioni Sequenza dalla biologia molecolare • danno diretto e indiretto della molecola del DNA • danno di molecole della membrana cellulare • danno degli organelli citoplasmatici • innesco dei meccanismi molecolari della reazione cellulare • attivazione della espressione genica di mediatori chimici quali citochine e fattori di crescita • induzione di una complessa cascata di eventi molecolari a livello della cellula, della matrice intercellulare, delle strutture stromali i cui effetti possono manifestarsi in un range temporale estremamente ampio • morte mitotica • differenziazione e avvio alla morte apoptotica • manifestazioni della flogosi • fibrosi • angiogenesi • cancerogenesi • etc: Tempo di latenza: tempo necessario perché gli eventi molecolari verificatisi al momento della interazione producano un effetto visibile

14. Radiobiologia molecolare Eventi del danno radiobiologico regolati da mediatori espressi da geni attivati dalla esposizione alle radiazioni • Induzione morte apoptica • Induzione mediatori della flogosi (reazione acuta) • Induzione danno endoteliale (necrosi tardiva) • Induzione produzione collageno (fibrosi tardiva) • Arresto progressione ciclo (riparazione DNA) • Induzione proliferazione (ripopolazione) • Variazione microambiente < produzione ROS (radioresistenza)

15. Dose effect relationship Danno cellulare • studio dell’effetto delle radiazioni sulla capacità delle cellule di moltiplicarsi • impiego di sistemi cellulari proliferanti in condizioni sperimentali • studio dei meccanismi generali della risposta cellulare Danno tessutale • studio degli effetti morfologici e funzionali delle radiazioni su uno specifico tessuto organizzato Danno clinico • Studio delle conseguenze cliniche del danno su un determinato tessuto Effetto terapeutico • Studio comparativo dell’effetto sulla malattia da curare rispetto ai tessuti sani circostanti

16. Metodi di studio della capacità clonogenica Cellula staminale • Capacità di replicarsi indefinitamente • Capacità di rispondere a meccanismi omeostatici • Mantenimento del compartimento staminale • Mantenimento del compartimento differenziato Cellula clonogenica • Cellula capace se messa in condizioni opportune di andare incontro a 5-6 generazioni di cellule formando un accumulo di almeno 50 cellule Test di capacità clonogenica • Tecniche per misurare l’effetto delle radiazioni sulla capacità di formare colonie di cellule clonogeniche • Importanti per lo studio dell’effetto delle radiazioni sulle cellule tumorali proliferanti

17. Studio della capacità clonogenica Curve di sopravvivenza cellulare Mettono in relazione: • la dose di radiazioni • la frazione della popolazione cellulare irradiata che sopravvive misurata dalla capacità clonogenica (cellule che conservano la capacita di formare colonie) Forma delle curva di sopravvivenza (radiazioni a basso LET) in scala lineare • sigmoide • la sensibilità delle cellule irradiate può essere espressa dalla dose necessaria per ridurre la capacità clonogenica del 50% (ED50) o del 90% (ED90) che però non da indicazioni sulla morfologia della curva in scala semilogaritmica • spalla seguita da tratto rettilineo • dopo la spalla l’effetto è funzione esponenziale della dose • la spalla esprime la capacità della cellula di riparare una parte del danno • la pendenza della fase esponenziale esprime la sensibilità cioè la dose necessaria per ottenere un certo livello di effetto ed è indicata da D0 (dose che riduce la fraz. sopravv. a e ) -1

18. Studio della capacità clonogenica Danno letale e danno subletale • La presenza della spalla nella curva di sopravvivenza può essere interpretata supponendo due possibili modalità di danno cellulare Danno letale • danno direttamente letale non riparabile (DSB) Danno subletale • danno che “può” essere riparato dai meccanismi enzimatici intracellulari restaurando la capacità clonogenica • è espressa dalla larghezza della spalla (dose necessaria prima di entrare nel tratto esponenziale) • la riparazione del danno subletale richiede alcune ore dopo la esposizione • è dimostrata la esistenza di una quota del danno subletale che dipende dalle caratteristiche dell’ambiente in cui la popolazione cellulare è mantenuta dopo la esposizione • questa quota di danno riparabile si indica con il nome di danno potenzialmente letale La forma della curva dose effetto di una popolazione cellulare ne indica la radiosensibilità

19. Studio della capacità clonogenica i parametri della curva dose effetto possono variare in rapporto a: • larghezza della spalla • pendenza tratto esponenziale • tipo di popolazione cellulare • qualità della radiazione • tipo di effetto considerato • condizioni ambientali durante (ossigeno, temperatura) e dopo la esposizione • aggiunta di farmaci • La capacità di riparazione e quindi la radiosensibilità di una stessa cellula varia durante le fasi del ciclo cellulare • maggiore in G2 e M • minore in S e G

20. 4 R’s of radiation biology • Repair of cellular damage • Reoxygenation of the tumor • Redistribution within the cell cycle • Repopulation of cells

21. Repair of sublethal injury • Sublethal injury – cells exposed to sparse ionization fields, can be repaired • Killing requires greater total dose when given in several fractions • Most tissue repair in 3 hours, up to 24 hours • Allows repair of injured normal tissue, potential therapeutic advantage over tumor cells • Radioresistance – melanoma?

22. Reoxygenation • Oxygen stabilizes free radicals • Hypoxic cells require more radiation to kill • Hypoxic tumor areas • Temporary vessel constriction from mass • Outgrow blood supply, capillary collapse • Tumor shrinkage decreases hypoxic areas • Reinforces fractionated dosing • Hypoxic cell radiosensitizers, selective chemo

23. Redistribution • Cell cycle position sensitive cells • S phase – radioresistant • G2 phase delay = increased radioresistance • RAD9 gene mutation – radiosensitive yeast • H-ras and c-myc oncogenes - G2 delay • Fractionated XRT redistributes cells • Rapid cycling cells more sensitive (mucosa, skin) • Slow cyclers (connective tissue, brain) spared

24. Repopulation • Increased regeneration of surviving fraction • Rapidly proliferating tumors regenerate faster • Determines length and timing of therapy course • Regeneration (tumor) vs. Recuperation (normal) • Reason for accelerated treatment schedules • Reason against: • Treatment delay • Protracted XRT, split course XRT (designed delay)

25. Modelli dell’effetto radiobiologico Le curve dose effetto sono state analizzate per elaborare modelli matematici con i quali interpretare il meccanismo di azione delle radiazioni Tutti i modelli matematici assumono : • che la cessione di energia nella materia sia un processo random • che la morte cellulare sia connessa al verificarsi di una interazione a livello di sedi particolarmente critiche delle cellula ai fini della sua possibilità di divisione • che esistano nella molecola del DNA alcune sedi la cui integrità è indispensabile per consentire la divisione cellulare • che la evenienza di una doppia rottura in una o più di tali sedi sia la causa della morte cellulare • che tali sedi siano pertanto da considerare i bersagli o “target” che devono essere colpiti per avere l’effetto biologico Tra gli scopi dei modelli matematici è quello di rendere i dati sperimentali trasferibili all’ambito terapeutico, per la elaborazione di strategie atte a migliorare l’effetto sul tumore e a ridurre gli effetti sui tessuti sani

26. Modello single target single hit • In ogni cellula esiste un solo bersaglio sensibile la cui inattivazione produce la morte della cellula • La inattivazionedella capacità riproduttiva richiede un unico evento in questo bersaglio in ogni cellula • Uno certo numero di eventi (hit) dovranno verificarsi nella cellula perché uno di questi colpisca il bersaglio • La curva che descrive l’andamento della sopravvivenza cellulare in funzione della dose somministrata è di tipo esponenziale (lineare in carta semilogaritmica) • La somministrazione di dosi successive distrugge sempre la stessa % di cellule sopravvissute • La radiosensibilità della popolazione è espressa dalla pendenza della retta • La pendenza corrisponde alla dose (D°) che riduce la popolazione cellulare da 1 a 0.37 (e ) • D° è la dose che produce una media di 1 evento (hit) per target -1 -1

27. Modello multi target single hit In ogni cellula esistono più (n) bersagli sensibili in ognuno dei quali devono verificarsi almeno un evento per avere la perdità della capacità riproduttiva • La curva che descrive l’effetto ha una spalla iniziale e una seconda parte esponenziale • La larghezza della spalla dipende dal numero di bersagli che devono essere colpiti prima di determinare la morte della cellula • N = numero di estrapolazione definisce il numero dei bersagli • Dq = è la dose dopo la quale la curva assume un andamento esponenziale • D° esprime la pendenza del tratto esponenziale • Le cellule che hanno dopo la esposizione un numero di bersagli colpiti inferiore a (n) possono riparare il danno entro alcune ore • La larghezza della spalla condiziona l’effetto del frazionamento della dose

28. Modello lineare quadratico (LQ) • La inattivazione della capacità riproduttiva può avvenire sia per un singolo evento in un singolo target che per più eventi nello stesso target • La prima modalità di danno(componente alfa) ha un andamento lineare con la dose • la seconda (componente beta) un andamento quadratico (l’effetto è proporzionale al quadrato della dose) • La curva dose effetto risultante è priva di un tratto retto • La prevalenza della prima o della seconda modalità di inattivazione determina la forma della curva La morfologia della curva può essere descritta dal rapporto alfa / beta

29. Modello lineare quadratico -1 Componente alfa • componente lineare del danno (Gy ) • corrisponde al danno direttamente letale (non riparabile) • può essere identificata con gli eventi di DSB • è prevalente nelle linee cellulari con scarsa capacità di riparazione • è prevalente con radiazioni ad alto LET • è prevalente a basso dose rate • risente poco del frazionamento Componente beta • componente quadratica del danno (Gy ) • corrisponde al danno riparabile • può essere identificata con gli eventi di SSB • è prevalente nelle linee cellulari con alta capacità di riparazione • risente molto del frazionamento -2

30. Modello lineare quadratico Rapporto alfa / beta Poiché: • il parametro “alfa” ha le dimensioni del Gy • il parametro “beta” ha le dimensione del Gy • Alfa / beta ha le dimensioni del Gy -1 -2 Alfa / beta è la dose (in Gy) alla quale la contribuzione del danno di tipo lineare corrisponde a quella del danno di tipo quadratico • Alfa / beta alto • prevalenza di danno non riparabile • la curva dose effetto tende ad essere rettilinea dall’origine • Alfa / beta basso • prevalenza di danno riparabile • la curva dose effetto ha una spalla iniziale più evidente

31. Modello lineare quadratico valori alfa / beta • Tessuti normali a risposta acuta • rapido ricambio cellulare • organizzazione gerarchica • cute • mucose alte vie aereo digestive • intestino • midollo emopoietico • Tumori a rapido ritmo proliferativo 7 – 20 Gy • Tessuti normali a risposta tardiva • lento ricambio • organizzazione di tipo flessibile • rene • fegato • tessuto nervoso (encefalo, midollo spinale • Tumori e lento ritmo proliferativo 0.5 - 6 Gy

34. Gy-1 Gy cell/cm3 Prostate FOWLER J., CHAPPELL R. and RITTER M., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 50,4, 1021-1031, 2001.