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Metabolismo dell

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    1. Metabolismo dellazoto

    2. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 2 -

    3. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 3 -

    4. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 4 -

    5. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 5 - Metabolismo dellazoto

    6. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 6 - Ciclo dellazoto

    7. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 7 - Metabolismo dellazoto Lazoto presente nei composti organici in forma ridotta. NH4+ Nellambiente lazoto presente in forma ossidata N2 NO3-

    8. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 8 - Metabolismo dellazoto Le specie ossidate vengono convertite nella specie ridotta da due diversi processi: Assimilazione del nitrato (avviene negli eucarioti fototrofi, piante verdi) NO3- ? NH4+ Fissazione dellazoto (avviene nei procarioti sia autonomi che simbionti di eucarioti) N2 ? NH4+

    9. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 9 - Assimilazione del nitrato Nelle piante verdi (eucarioti) lassimilazione del nitrato avviene in due successivi passaggi:

    10. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 10 - Nitrato reduttasi La nitrato reduttasi citosolica trasferisce due elettroni dal NADH al nitrato. Contiene come cofattori: FAD Cofattore molibdeno Citocromo b577

    11. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 11 - Nitrato reduttasi

    12. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 12 - Nitrato reduttasi

    13. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 13 - Nitrato reduttasi La nitrato reduttasi citosolica trasferisce due elettroni dal NADH al nitrato. La catena di trasferimento elettronico:

    14. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 14 - Nitrito reduttasi

    15. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 15 - Nitrito reduttasi EC 1.7.1.4 La nitrito reduttasi presente nei cloroplasti agisce attraverso la ferredossina ridotta dalla fotosintesi, Il trasferimento di elettroni coinvolge un gruppo siroeme nel quale il ferro complessa lo ione nitrito che viene ridotto a ione ammonio.

    16. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 16 - Fissazione dellazoto Avviene nei procarioti che possono essere sia simbionti di piante superiori che avere vita autonoma Requisiti essenziali per la fissazione dellazoto: Un riducente ferredossina, EC 1.18.6.1 flavodossina, EC 1.19.6.1 ATP Anaerobiosi Meccanismi di regolazione

    17. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 17 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi Il complesso enzimatico della nitrogenasi composta di due proteine entrambe richieste per lattivit: La nitrogenasi reduttasi e La nitrogenasi La nitrogenasi reduttasi una proteina 4Fe-4S che, legando due molecole di ATP e una ferredossina, genera un elettrone che viene trasferito alla nitrogenasi. La nitrogenasi, catalizza la reazione: N2 ? 2NH4+

    18. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 18 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi La nitrogenasi riduce lazoto a ione ammonio attraverso tre riduzioni successive nella quale utilizza due elettroni per volta. La riduzione avviene come: N2 + 2e- + 2H+ ? NH=NH + 2e- + 2H+ ? ? NH2-NH2 + 2e- + 2H+ ? 2NH4+ + H2 La riduzione porta alla formazione di H2. Lo stesso enzima porta alla produzione di etilene (e etano) da acetilene, di azoto e ammonio da azide e metano e ammonio dal cianuro. In assenza di un substrato disponibile si ha la lenta produzione di H2. La ferredossina pu essere rimpiazzata dalla flavodossina (EC 1.19.6.1).

    19. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 19 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi Richiede la presenza di Mg++ Richiede ATP nonostante che la reazione: N2 + 8e- + 10H+ ? 2NH4++ H2 sia termodinamicamente favorita, (DG << 0), invece elevata lenergia di attivazione (DG* > 0) Il sistema fortemente inibito dallO2, ma richiede ATP, formato da O2, gli organismi simbionti che usano la nitrogenasi operano al limite tra il poco ossigeno per evitare linibizione e lossigeno necessario a formare ATP, sfruttando lemoglobina dellospite.

    20. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 20 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi Nitrogenasi reduttasi: un enzima che opera in anaerobiosi (sensibile all O2), peso molecolare 60KD, contiene un centro Fe4S4.

    21. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 21 - Il complesso enzimatico della nitrogenasi Nitrogenasi EC 1.18.6.1 : un enzima Fe Mo

    22. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 22 - Nitrogenasi

    23. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 23 - Regolazione della nitrogenasi I geni per la nitrogenasi e la nitrogenasi reduttasi fanno parte di un complesso genico chiamato regulone nif. Il regulone nif comprende: i geni strutturali per il complesso della nitrogenasi, i geni per il complesso FeMo, i geni che controllano le proteine implicate nel trasporto di elettroni, diversi geni regolatori.

    24. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 24 - Regolazione della nitrogenasi La nitrogenasi sottoposta a una regolazione molto rigorosa. La fissazione dell'azoto inibita da 02 dalla presenza di azoto combinato, NH3, N03 e alcuni aminoacidi. La regolazione avviene soprattutto a livello della trascrizione: La trascrizione dei geni nif strutturali attivata dalla proteina NifA (regolazione positiva) e repressa dalla proteina NifL, (regolazione negativa)

    25. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 25 - Regolazione della nitrogenasi Il sistema della nitrogenasi regolato sia a livello dellattivit enzimatica (feedback negativo da prodotto) che a livello dellespressione genica della nitrogenasi:

    26. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 26 - Nitrogenasi reduttasi Il sistema della nitrogenasi regolato anche a livello della reduttasi attraverso la formazione di un derivato ADP-ribosilato:

    27. AMMONIO NH3 + H+ NH4+

    28. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 28 - Destino di NH4+

    29. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 29 - Tre enzimi

    30. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 30 - Catalizza una delle tappe del ciclo dellurea Una molecola di ATP attiva il bicarbonato Una molecola di ATP fosforila il carbammato N-acetiglutamato un attivatore allosterico essenziale Carbamilfosfato sintasi I (EC 6.3.4.16)

    31. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 31 - Carbamilfosfato sintasi I (EC 6.3.4.16)

    32. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 32 - Glutamato deidrogenasi (GDH) (EC 1.4.1.X)

    33. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 33 - Glutamato deidrogenasi (GDH) (EC 1.4.1.X)

    34. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 34 - Glutamina sintasi (GS) (EC 6.3.1.2) Dodecamero Meccanismo:

    35. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 35 - Glutamina sintasi (GS) (EC 6.3.1.2)

    36. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 36 - Correlazione e competizione tra GDH e GS

    37. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 37 - GOGAT

    38. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 38 - GOGAT

    39. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 39 - Regolazione allosterica della GS La glutamina un componente centrale nella biosintesi degli aminoacidi e dei nucleotidi, La sua sintesi estremamente regolata: In modo allosterico, da prodotti che provengono dalla glutamina, In modo covalente, Attraverso la regolazione genica. Linibizione allosterica, da prodotti, cumulativa, mediamente ogni inibitore presente a concentrazione saturante satura l11% dellattivit.

    40. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 40 - Regolazione allosterica della GS

    41. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 41 - Regolazione covalente della GS Ognuna delle dodici subunit della glutamina sintasi pu essere adenilata in Tyr397 La GS adenilata pi sensibile allinibizione cumulativa e al feeback. un meccanismo finemente regolato, non on-off.

    42. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 42 - Regolazione covalente della GS Nella regolazione covalente sono coinvolti due enzimi: Il complesso adenililtransferasi, un tetramero di 11kD che viene regolato covalentemente attraverso il legame con il gruppo uridile: PIIA ? Uridil-PIID Luridiltransferasi che catalizza la formazione di Uridil-PIID Lo stato di PII controlla la direzione in cui ladenilitransferasi agisce. Ladenililtransferasi (nelle due forme) e luridiltransferasi sono regolate in modo allosterico da a-chetoglutarato e glutamina.

    43. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 43 - Regolazione genica della GS Il gene che codifica per GS (GlnA) attivato solo se uno specifico attivatore della trascrizione NRI fosforilato (NRI-PO3--)

    44. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 44 - Biosintesi degli aminoacidi Non tutti gli organismi viventi riescono a sintetizzare gli aminoacidi a partire dallo ione NH4+: Piante, batteri e lieviti: NO3- ? NH4+ ? glutamato ? Aminoacidi Nei mammiferi: Aminoacidi essenziali: Arg, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val. Aminoacidi non essenziali: Ala, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, Pro, Ser, Tyr.

    45. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 45 - Biosintesi degli aminoacidi Gli aminoacidi vengono, nella maggior parte dei casi, sintetizzati a partire dalla-chetoacido corrispondente attraverso una specifica aminotransferasi (transaminasi): AA1 + a-chetoacido2 ? a-chetoacido1 + AA2 Le transaminasi trasferiscono un gruppo aminico da un AA ad un a-chetoacido

    46. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 46 - Transaminazione Le reazione di transaminazione usano come coenzima il piridossal fosfato. Il piridossal fosfato forma una base di Shiff con un residuo di Lys della transaminasi

    47. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 47 - Meccanismo della transaminazione

    48. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 48 - Meccanismo della transaminazione

    49. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 49 - Meccanismo della transaminazione

    50. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 50 - Biosintesi degli aminoacidi Gli aminoacidi possono essere raggruppati in base agli intermedi dai quali provengono: Famiglia della-chetoglutarato: Glu, Gln, Pro, Arg, Lys. Famiglia dellaspartato: Asp, Asn, Met, Thr, Ile, Lys. Famiglia del fosfoenolpiruvato e delleritrosio-4-fosfato: Phe, Tyr, Trp Famiglia del piruvato: Ala, Val, Leu Famiglia del 3-fosfoglicerato: Ser, Gly, Cys Dal fosforibosilpirofosfato: His

    51. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 51 - Degradazione degli aminoacidi A differenza degli acidi e grassi e dei glucidi gli aminoacidi in eccesso non possono n essere immagazzinati in macromolecole di deposito n essere escreti come tali, vengono quindi demoliti.

    52. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 52 - Proteolisi Idrolisi del legame peptidico Nellintestino delluomo sono presenti diverse proteasi secrete da diversi organi digestivi: Dallo stomaco: pepsina Dal pancreas: chimotripsina e tripsina Dallintestino tenue: peptidasi intestinali (leucina aminopeptidasi.

    53. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 53 - Pepsina Secreta dalle cellule della mucosa gastrica (che secernono anche HCl) come pepsinogeno inattivo (40 kD): Taglia con maggior frequenza legami tra aminoacidi aromatici, Met, Leu e produce peptidi e pochi aminoacidi liberi.

    54. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 54 - Chimotripsina e tripsina

    55. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 55 - Peptidasi intestinali

    56. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 56 - Ossidazione degli aminoacidi La degradazione degli aminoacidi un processo complesso che coinvolge un numero molto grande di intermedi: Catena Carboniosa Azoto ammoniacale: Urea NH3 Azoto basi azotate: Acido urico Urea NH3

    57. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 57 - Azoto Il primo stadio della degradazione degli aminoacidi la rimozione del gruppo amminico attraverso le aminotransferasi: AA1 + a-chetoacido2 ? a-chetoacido1 + AA2

    58. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 58 - Azoto

    59. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 59 - Transaminazione Le reazione di transaminazione usano come coenzima il piridossal fosfato. Il piridossal fosfato forma una base di Shiff con un residuo di Lys della transaminasi (EC 2.6.1.X, uno per ogni aminoacido).

    60. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 60 - Meccanismo della transaminazione

    61. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 61 - Meccanismo della transaminazione

    62. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 62 - Meccanismo della transaminazione

    63. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 63 - Meccanismo della transaminazione Il PLP legato alla Lys come base di Shiff

    64. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 64 - Meccanismo della transaminazione Si lega lAA, la molecola tenuta in sede da due Arg che danno la specificit

    65. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 65 - Meccanismo della transaminazione Si forma la-chetoacido e la piridossamina.

    66. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 66 - Meccanismo della transaminazione

    67. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 67 - PLP Il PLP un sistema molto versatile per trasformare aminoacidi: Il legame C-H (A) reso pi labile nelle transaminasi Il legame C-COO- (B) reso pi labile nelle decarbossilasi Il legame C-R (C) reso pi labile nelle aldolasi Gli enzimi con PLP catalizzano anche reazioni al Cb e Cg.

    68. Metabolismo dellazoto Ciclo dellurea

    69. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 69 - Eliminazione dellazoto La forma molecolare con la quale viene eliminato da un organismo dipende dalla disponibilit di acqua: Ammonio: Ammoniotelici Invertebrati acquatici Urea: Ureotelici Pesci, anfibi, bivalvi di acqua dolce Acido allantoico Alcuni teleostei Allantoina Molluschi, insetti, mammferi (non primati) Acido Urico: Uricotelici Insetti, vermi, rettili, uccelli, primati.

    70. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 70 - Eliminazione dellazoto

    71. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 71 - Ciclo dellurea

    72. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 72 - Ciclo dellurea

    73. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 73 - Ciclo dellurea La carbamil-fosfato sintasi catalizza la reazione di formazione di carbamil-fosfato da CO2 e NH3. Intervengono due molecole di ATP, Lenzima deve essere attivato da un effettore allosterico, il N-Acetilglutamato. Questo derivato proviene da acetil-CoA e glutamato quando la concentrazione dei questultimo alta, segnale di un eccesso di aminoacidi liberi.

    74. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 74 - Ciclo dellurea Le due molecole di ATP operano in questo modo: la prima attiva in carbonato (CO2) per formare il carbonil-fosfato, Lammoniaca si lega e forma il carbammato liberando il fosfato, La seconda molecola di ATP lega il carbammato attivandolo.

    75. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 75 - Ciclo dellurea Il carbamil-fosfato si lega allornitina per formare la citrullina. Queste due reazioni avvengono nella matrice mitocondriale dove lornitina stata trasportata da un trasportatore specifico

    76. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 76 - Ciclo dellurea La citrullina viene trasportata fuori dalla matrice mitocondriale da un trasportatore specifico e, nel citoplasma, si combina con laspartato per dare largininosuccinato. Lenzima responsabile largininosuccinato sintasi che catalizza prima la formazione del Citrullil-AMP a spese di ATP e quindi il legame con laspartato.

    77. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 77 - Ciclo dellurea Una liasi (Argininosuccinato liasi) promuove la scissione dellarginino siccinato in fumarato e arginina. Larginina anche precursore dellossido di azoto (NO).

    78. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 78 - Ciclo dellurea Il fumarato pu venire riciclato ad aspartato attraverso la formazione di malato e ossalacetato, queste trasformazioni sono catalizzate da isoenzimi citosolici di analoghi enzimi del ciclo di Krebs (mitocondriali). Le transaminasi si occupano poi di convertire lossalacetato in aspartato che viene riutilizzato nella tappa precedente.

    79. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 79 - Ciclo dellurea Larginina viene infine convertita in ornitina (OUT) e Urea da una arginasi.

    80. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 80 - Ciclo dellurea

    81. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 81 - Ciclo dellurea e NO

    82. v. 1.4.1 gsartor 2001-2008 Metabolismo dell'azoto - 82 - Catena carboniosa

    83. Crediti e autorizzazioni allutilizzo Questo materiale stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica: CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 978-8808-17030-9] Zanichelli NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICAcon aspetti molecolari della Biologia cellulare - Zanichelli VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 978-8808-06879-8] - Zanichelli E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali: Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/ Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/ Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/ Rensselaer Polytechnic Institute: http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html Il materiale stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla Orlandini dellUniversit di Parma alla quale va il mio sentito ringraziamento. Questo ed altro materiale pu essere reperito a partire da: http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/ Il materiale di questa presentazione di libero uso per didattica e ricerca e pu essere usato senza limitazione, purch venga riconosciuto lautore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Universit di Bologna a Ravenna Giorgio Sartor - giorgio.sartor@unibo.it

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