1 / 19

Viruslarda Enfeksiyozite Ölçümü

Viruslarda Enfeksiyozite Ölçümü. Titrasyon. Titrasyon. Bir virusun enfeksiyozite gücünün hesaplanmasına o virusun titrasyon u, enfeksiyozite gücüne ise o virusun titre si adı verilir. Titrasyonun Kullanım Alanları. -Nötralizasyon testinde kullanılan virusun standardizasyonunda

otis
Download Presentation

Viruslarda Enfeksiyozite Ölçümü

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. ViruslardaEnfeksiyozite Ölçümü Titrasyon

  2. Titrasyon Bir virusun enfeksiyozite gücünün hesaplanmasına o virusun titrasyonu, enfeksiyozite gücüne ise o virusun titresi adı verilir. Titrasyonun Kullanım Alanları -Nötralizasyon testinde kullanılan virusun standardizasyonunda -İnaktivasyon kinetiğinde -Aşı hazırlamada -Virus saflaştırmada -Virus izolatlarının identifikasyonu ve klasifikasyonunda..

  3. TİTRASYON (kullanılan konakçı sisteme göre) İn-vitro titrasyon İn-vivo titrasyon • - Makro titrasyon (DKID50) - Deneme hayvanlarında (LD50, MID50) • - Mikro titrasyon (DKID50) - ETY’lerde (YID50) • - Plak titrasyon (plak test) (POU)

  4. Makrotitrasyon Mikrotitrasyon Plak titrasyon

  5. 1 ml TİTRASYON 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml Virus 9 ml PBS 10-110-210-3 10-410-510-610-710-8

  6. Log10 DKID 50 = [ Xo - d/2 + d x (r/n) ] Xo = Tüm gözlerde CPE görülen en son sulandırma değerinin log10’u d = Sulandırma faktörünün log10’u r = Xo ve daha sonraki sulandırmalarda tespit edilen CPE pozitif gözlerin toplamı n = Her sulandırma basamağı için kullanılan konakçı sistem sayısı

  7. Log10 DKID 50 = [ Xo - d/2 + d x (r/n) ] Sulandırma Basamağı CPE/Göz sayısı 10-14/4 10-2 4/4 10-3 4/4 10-43 / 4 10-52/4 10-60/4 HK 0/4 VK 4/4 log10 DKID 50 = [ ( 3 – ½ + 1 x (9 / 4)] log10 DKID 50 = - 4,75 DKID 50 =10-4,75 / 0.1 ml 100DKID 50 =10-2,75 / 0.1 ml

  8. DKID50 ne demek? • İnokule edildiği in vitro sistemlerin EN AZ yarısında cpe oluşturan virus sulandırma değeri. • Hangi virusuntitresi daha büyük? • DKID50 : 10-4,25/0.1 mL • DKID50 : 10-5,30/0.1 mL

  9. Plak Titrasyon (Plak Test) • Enfekte hücre kültüründe virus çoğalması nedeniyle oluşan etrafı sınırlı • boşluklara Plak adı verilir. • Plaklar oluşumlarına göre; • Litik Plaklar: Ortalarının boş olması ile, • Dejeneratif Plaklar: Ortalarınında dejenere olmuş hücrelerin bulunması • Proliferatif Plaklar: Ortalarında yoğun hücre proliferasyonunun bulunması.

  10. Ne amaçla kullanılır? • Virusların enfeksiyoziteleri hakkında bilgi sahibi olmak, • Virusları klonlamak-saflaştırmak, • Virusları konsantre etmek

  11. Sağlıklı bir Plak Testte: • Enfekte edilmemiş kontrollerde Plak oluşmamalı, • İnokule edilen virusun Plak oluşturma özelliği olmalı, • Plak sayısı virus dozu ile paralel olarak atış göstermeli, • Plak oluşumları spesifik immun serumlarla durdurulabilmeli, • Aynı virusla yapılan Plak Testler aynı sonucu vermelidir.

  12. Testin Yapılışı: • Virus log10’a göre tüplerde sulandırılır, • Her sulandırma basamağı için 2’şer petri kullanılır, • Petri kutusundaki hücrelere adsorbsiyonlu metod ile virus inokulasyonu • yapılır, • 37oC’lik CO2’li etüvlerde 1 saat bekledikten sonra, • 2xEarle + % 1.8-2’lik Noble agar karışımı virus üretme vasatı olarak • kullanılır, • Petriler CO2’i etüvlere kaldırılır, her gün DK mikroskobunda incelenir, • Plakların daha iyi görülebilmesi için canlı hücreler Nötral Red ile boyanır. • Plaklar sayılarak PFU (Plak Formation Unit) tespit edilir.

  13. Virus Üretme Vasatı Olarak; 2xEarle + %1,8-2’lik Noble Agar Oluşan Pakların daha iyi görülebilmesi için hücreler üzerine; Nötral Red + 2xEarle + %1,8-2’lik Noble Agar kullanılır.

  14. Değerlendirme; Sulandırma / Plak sayısı 10-1 : çok 10-2 : çok 10-3 : çok 10-4 : çok 10-5 : 100 den fazla 10-6 : 81 10-7 : 2 10-8 : 0 PFU: 81x10-6

  15. Viral Enfeksiyonların Tanısı

  16. Viral Enfeksiyonlarda Teşhis Direkt Teşhis İndirek Teşhis (Virus/Antijen tespiti) (Antikor tespiti) Virusu Üretmeksizin Virusu Üreterek AGID KFT ELISA SN TPHA NIF NPLA RIA • Virusun eldesi • Tiplendirme • Fiziksel (ısı-pH) • Kimyasal • (eter, kloroform, • 5IDUR, 5BDUR) • Biyolojik Özellikleri • (Hemadsorbsiyon, • Hücre spektrumu, • Konakçı spektrumu) - Morfolojik Tanı (EM) - Histopatoloji (İnkluzyon cisimciği tespiti) - Bilinen İmmun serum kullanarak Ag tespiti - PCR - PAGE

  17. Fiziksel – Kimyasal İdentifikasyon Kriteleri 1- Nükleik asit tayini 2- Filtrasyon ile yaklaşık virus büyüklüğünün tespiti 3- Isı hassasiyet testi 4- Tripsin hassasiyet testi 5- pH hassasiyet testi 6- Çift değerli katyonlarla muamele 7- Lipit eritici maddelerle muamele 8- Hemaglutininlerin tespiti 9- Elektron mikroskopi

  18. Virusların İdentifikasyonunda kullanılan Fiziksel ve Kimyasal testler • Nükleik asit tayini (DNA-RNA) • Virusların yağ eriticilerine karşı duyarlılığı • Virusların asit ve alkali değerlere duyarlılığı • Virusların ısıya dayanıklılık testleri • İki değerli katyonlarla ısı hassasiyet testi

More Related