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Por muitos anos a gen
E N D
1. Eletroforese Bidimensional como Ferramenta Proteômica Prof. Carlos André O. Ricart
CBSP-Centro Brasileiro de Pesquisa em Proteínas
Departamento de Biologia Celular
Universidade de Brasília
2. Por muitos anos a genômica funcional propagou a noção de que não seria necessário estudar níveis de proteínas para obter-se dados de “up and down regulation”. Tudo o que era necessário seria a determinação dos níveis de mRNA
3. Em 1997, Anderson apresentou um trabalho mostrando a primeira comparação da abundância de mRNA e proteínas correspondentes. A correlação foi de 0,43…
Anderson &Seihamer (1997) Electrophoresis 18, 533-537
Esses resultados vem sendo confirmados por outros grupos
4. A proteômica, portanto, parece ser a ferramenta mais apropriada para entender-se o funcionamento dos genes, pois analisa o produto final do genoma
5. A abordagem proteômica exige a separação de proteínas com alta resolução para posterior análise
6. Apesar de antiga, até o momento não surgiu uma metodologia capaz de resolver mais proteínas simultaneamente do que a eletroforese bidimensional
7. Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE) 1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de O´Farrel; Klose ; MacGillivray et al.
Etapas Básicas:
1- Focalização Isoelétrica (IEF)
2-Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
8. Por muitos anos a 2D-PAGE sofria do “defeito contemplativo”
9. Um gande passo no uso da 2D-PAGE ocorreu com o progresso nas técnicas analíticas de identificação de proteínas
10. 2D-PAGE: etapas principais Preparação da amostra
Focalização Isoelétrica
SDS-PAGE
Detecção
Digitalização e análise de imagem
11. Focalização Isoelétrica (IEF) As moléculas migram sob a ação de um campo elétrico em um gel contendo um gradiente de pH. A migração se interrompe ao atingirem seu ponto isoelétrico
Aplicada a moléculas que possam ser tanto positivamente ou negativamente carregadas (anfotéricas)
12. Cadeias laterais das proteínas possuem grupos ionizáveis carboxílicos(Asp,Glu), aminos (Lys), imidazóis (His) e guanidino (Arg)
R-COO- + H+ R-COOH
R-NH3+ + OH- R-NH2 + H2O
13. A carga líquida de uma proteína é função da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga é zero no seu ponto isoelétrico (pI)
O pI de uma proteína pode ser alterado por modificações químicas como fosforilações
O pré-requisito para uma boa IEF é a formação de gradiente de pH estável e reprodutível
14. Gradientes de pH A focalização isoelétrica é realizada em géis de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos:
Tampões anfotéricos (“free carrier ampholytes”)
Gradientes imobilizados de pH (IPG)
15. Tampões anfotéricos (“free carrier ampholytes”) CH2-N-(CH2)X -N-CH2-
| |
(CH2) X (CH2) X
| |
NR2 COOH
R= H ou -(CH2) X -COOH, X=2
Propriedades:boa condutividade e solubilidade no pI, alta capacidade tamponante, baixa interação com a amostra
16. Gradiente de pH com“ampholytes” Com o uso dos “ampholytes” o gradiente de pH é formado sob ação de um campo elétrico
Desvantagens: resultado depende do tempo de focalização, temperatura e efeitos endosmóticos
Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH
17. Gradientes imobilizados de pH (IPG) Gradiente formado com derivados de acrilamida contendo grupos tamponantes (“Immobilines”)
CH2 = CH-C - N - R
|| |
O H R-grupo carboxílico ou amino
Método altamente reprodutível pois os grupos tamponantes estão fixados ao gel
Propicia uma alta capacidade de aplicação de amostra e uma baixa condutividade durante a focalização
Géis prontos são disponíveis comercialmente
18. Formação de gel de IPG
19. Diagrama de uma rede de poliacrilamida com Immobilines co-polimerizados
20. Reidratação de géis de IPG
Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH
21. Equipamentos usados no CBSP para Focalização Isoelétrica MultiPhor II (Amersham Biosciences)
IPGPhor (Amersham Biosciences)
24. IPG Phor
25. IEF: Aplicação da amostra Aplicação direta sobre o gel de IPG,
Aplicação simultânea à reidratação do gel
26. Aplicação usando “sample cups” A amostra deve ser aplicada em um dos extremos de pH (perto do catodo ou do anodo) onde a maioria das proteínas está carregada, minimizando perdas por precipitação
27. Aplicação durante a reidratação O gel de IPG é reidratado na solução contendo a amostra
Permite aplicação de maior quantidade de proteínas (>10 mg)
Minimiza a precipitação de proteínas durante a entrada no gel, principalmente para proteínas de membrana
Evita a manipulação exigida durante a aplicação usando “sample cups”
28. Equilibrio do gel de IPG 15-30 min em solução contendo Tris, Uréia, Glicerol, DTT, SDS e bromofenol
15-30 min em solução contendo Tris, Uréia, Glicerol, iodacetamida, SDS e bromofenol
Após equilíbrio retirar excesso do tampão de equilíbrio lavando com tampão de corrida SDS-PAGE
29. Segunda dimensão SDS-PAGE Sistema horizontal. Ex.Mutiphor II Electrophoresis unit (Pharmacia Biotech)
Sistema vertical. Ex. SE 600, IsoDalt (Amersham), Investigator (Millipore), Protean II xi (BIO-RAD), etc.
31. Tamanho do poro T- concentração total de acrilamida
T= (a+b) x 100
V
C - porcentagem de “crosslinker”
C = b x 100
a + b
32. SDS-PAGE-sistema vertical Vantagens: Possibilidade de uso de equipamento pre-existente no laboratório, permite corridas simultâneas de vários géis dependendo do sistema utilizado
34. SDS-PAGE-Sistema horizontal Vantagens:Melhor resolução segundo a. Gorg, possibilidade de uso de géis “pre-casted”
Desvantagens: permite apenas duas corridas simultâneas
36. Composição dos tampões de amostra Tampões de amostra normalmente possuem:
Uréia
Detergente
Agente redutor
Anfólitos
Inibidores de proteases
37. Preparação da Amostra Para a focalização isoelétrica, as proteínas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas
38. O processo de solubilização deve, portanto, atingir os seguintes objetivos:
Quebrar interações macromoleculares incluindo todas as interações não covalentes e as pontes dissulfeto
Prevenir modificações nas proteínas
Manter as proteínas em solução durante a 2D-PAGE
39. Agentes Redutores
2-mercaptoetanol era usado nos primórdios. Sua ação tamponante destrói o gradiente de pH na região básica.
DTT é o mais utilizado. Obs: proteínas com muita cisteína não são totalmente reduzidas com DTT.
Tributilfosfina (TBP) é o mais potente agente redutor disponível. Obs: é volátil, tóxico e requer solvente orgânico para dissolver em água.
Tris(carbixietil) fosfine (Pierce Co.) é uma fosfina hidrossolúvel.
40. Rompimento de interações não covalentes
1- Agentes caotrópicos:
Uso de reagentes caotrópicos, como a uréia, por alterarem os parâmetros do solvente exercem profundos efeitos sobre todos os tipos de interações não covalentes.
A tiouréia é um agente caotrópico mais eficiente que a uréia, mas pouco solúvel em água.
A mistura uréia- tiouréia é bastante eficiente.
42. Cuidado com a carbamilação causada
pela uréia!
- A uréia em água existe em equilíbrio com cianato de amônio (cujos níveis aumentam com a temperatura.
- Cianato pode reagir com aminas (N-terminal ou lisinas).
- Consequência: heterogeneidade artefactual de carga, bloqueio N-terminal, etc.
- Como evitar: grau de pureza da uréia, evitar temperaturas acima de 37ºC, desionizar soluções de uréia e usar “scavengers” de cianato (amina primária).
43. Rompimento de interações não covalentes
2- Detergentes:
Rompem interações hidrofóbicas
Para a focalização isoelétrica, não podem ter carga líquida.Devem ser não-iônicos ou zwitterionicos
SDS deve ser evitado!!
Os mais compatíveis com as necessidades são o Triton X-100 e o CHAPS
44. Mantendo as proteínas intactas
Hidrolases (fosfatases, glicosidases e proteases)
Proteases são resistentes à uréia e a detergentes
Inibidores de proteases nem sempre são suficientes
Solubilização em SDS quente
Homogeinização da amostra em TCA diluído ou TCA-acetona
46. Remoção de sais
Os sais interferem diretamente no processo eletroforético. Eles migram através do gradiente de pH produzindo calor e acumulam-se nas duas extremidades. Isso causa zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuição do campo elétrico. Nessa zonas, as proteínas não focalizam e aparecem como faixas. As tiras de IPG incham nessas zonas de aalta condutividade devido ao acúmulo de água.Remoção por precipitação ou diálise.
47. Detecção Fatores importantes:
Faixa dinâmica de detecção
Linearidade
Reprodutibilidade entre experimentos
Variabilidade inter proteína
Compatibilidade com métodos de identificação
48. Principais métodos Coomassie Blue
Nitrato de Prata
Reagentes fluorescentes
Marcação radioativa
49. Apesar da enorme quantidade de trabalho proteômico, continuamos observando a ponta do iceberg.
A grande maioria das proteínas proteínas raras (e preciosas) ainda estão escondidas.
Todos estão identificando as mesmas proteínas (as mais abundantes)
50. Por que?
51. A abundância das proteínas varia muito
Ex: Nas células Humanas
Actina (108 cópias /célula)
Receptores celulares e fatores de transcrição (102-103 cópias /célula)
Dinamic range 105-106 !!!!
Dinamic range 2D-PAGE = ~104
52.
Obs: a situação é ainda pior em certas amostras como o soro sanguíneo onde albumina é presente em concentrações de 40 mg/mL e citocinas em pg/mL . Faixa dinâmica de 109
55. Como resolver este problema?
56. Uma opção é o pré fracionamento da amostra
57. Tipos de fracionamento
Celular
Cromatográfico
Eletroforético
58. Outra opção é o uso de gradientes estreitos de pH (“narrow pH gradients”)
61. Limitações da abordagem 2D-PAGE/MS Dificuldade de automação
Incapaz de detectar, identificar e quantificar todas as proteínas de amostras complexas simultaneamente
Dificuldade de resolver proteínas extremamente ácidas ou básicas, assim como as muito hidrofóbicas.
62. “2D or not 2D?” Se o objetivo é prover uma lista de todas as proteínas presentes em uma amostra, metodologias baseadas em cromatografia multidimensional acoplada à espectrometria de massa em sequência (MS/MS) pode fornecer resultados superiores
Se o objetivo for observar mudanças quantitativas na expressão de proteínas ou suas modificações pós traducionais durante um processo biológico, os géis bidimensionais ainda são inigualáveis.
