Non - inva ziv Prenatal Test: Fetal Trizomilerin Saptanmasında Yeni Bir Dönem

1. Non-invaziv Prenatal Test:  Fetal Trizomilerin Saptanmasında Yeni Bir Dönem

2. Trizomi Değerlendirmesinin Evrimi FPR=<0.1% FPR=5.0% Harmony Prenatal Test 2

3. Kullanılan Anöploidi Testlerinin Sınırları Zahmetli Çoklu doktor ziyaretleri Spesifik USG cihazı Yüksek false pozitif oran(%5) Geç informasyon Uzamış belirsizlik İnvaziv prosedürler (CVS ve amniosentez) nedeniyle güvenlik kaygıları 3

4. HarmonyTMPrenatal Test • Cell free fetal DNA’nın (cffDNA) varlığı (gücü) • Harmony ile MPSS’nin karşılaştırılması • Harmony’nin klinik performansı • Harmony’nin klinik uygulaması 4

5. HarmonyTMPrenatal Test • Cell free fetal DNA’nın (cffDNA) varlığı • Harmony ile MPSS’nin karşılaştırılması • Harmony’nin klinik performansı • Harmony’nin klinik uygulaması 5

6. Maternal Kanda Cell-Free DNA • Cell-free DNA (cfDNA) kısa DNA fragmentleridir. • Gebelikte, maternal kanda hem anne ve hem de fetusa ait cfDNA bulunur. • Mevcut fetal cfDNA miktarı, maternal cfDNA’nın küçük bir kısmıdır. 6

7. cfDNA ile Kromozom Sayımı Fetal cfDNA Maternal cfDNA Referans kromozom fragmentleri Kromozom 21 fragmentleri 7

8. cfDNA ile Fetal Trizominin Saptanması Fetal trizomi 21’den köken alan ekstra fragmentler Fetal cfDNA Maternal cfDNA Referans kromozom fragmentleri Kromozom 21 fragmentleri 8

9. HarmonyTMPrenatal Test • Cell free fetal DNA’nın (cffDNA) potansiyeli • Harmony ile MPSS’nin karşılaştırılması • Harmony’nin klinik performansı • Harmony’nin klinik uygulaması 9

10. NIPT Teknolojisi Günümüzde bu alanda kullanılan 2 farklı analiz yöntemi Directed Yöntem Harmony Prenatal Test Massively Parallel Shotgun Sequencing (MPSS) Anahtar farklılıklar Daha güvenli Kişiye özel risk skorlaması “pozitif/negatif” sonuçlar (z-skordan köken almış) 10

11. Yöntem karşılaştırılması– MPSS ve Directed Kandaki cfDNA Kromozom 21, 18, 13 cfDNA’sı Diğer kromozomlara ait cfDNA Haritalanmamış cfDNA Massively Parallel Shotgun Sequencing (MPSS) Directed analysis (DANSR) 11

12. MPSS ve z-score Analiz Metodu N=1696 • cut-off olaraktahminibir z-score değerikullanılaraktrizomitespitiyapılır. • z-score cut-off reflects the # of SDs from an expected mean • z-score=3: normal beklenen ortalama değerden 3SD kadar sapmayı gösterir • z-score=2: normal beklenen ortalama değerden 2SD kadar sapmayı gösterir Palomaki GE et al. Genet Med. 2011 12

13. Harmony Prenatal Test – Genel Bakış (Digital Analysis of Selected Regions) • Directed cfDNA testi • Daha güvenli • Çok sayıda hastanın aynı anda çalışılabilmesi FORTETM DANSRTM (Fetal-fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation) • İçeriği: • Fetal cfDNA fraksiyonu • Anne Yaşı • Gebelik haftası • Kişiye özel risk skorlaması 13

14. FORTE Anöploidi Analizi Giren Bilgi Çıkan Bilgi FORTE Kromozom 13, 18 ve 21 cfDNA sayısı Fetal DNA Klinik bilgi (anne yaşı ve gebelik haftası gibi) Trizomi 21 risk değeri Trizomi 18 risk değeri Trizomi 13 risk değeri *FORTE - Fetal-fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation 14

15. Fetal cfDNA Fraksiyonunun Önemi Fetal cfDNA Maternal cfDNA Referans Kromozom Kromozom 21 Analiz aşamasına fetal fraksiyonun da eklenmesi daha doğru sonuçlar elde edilmesini sağlar 15

16. Özet– Harmony Test ve MPSS MPSS • Random analiz • Fetal fraksiyon ve diğer klinik risk faktörleri hesaplanamaz • Örnekler, çok farklı test değerlerine rağmen random olarak 2 kategoriye ayrılır • Directed analiz • Fetal fraksiyon ve diğer klinik risk faktörlerini de içerir • Her bir trizomi için kişiselleştirilmiş risk skoru ile basit ve anlaşılır sonuçlar (Yüksek risk/Düşük risk) 16

17. Geniş Klinik Data 17

18. Klinik Çalışmalar – Karşılaştırmalı Data Yayınlanmış çalışmalardaki toplam hasta sayısı Klinik çalışma sayısı Bağımsız çalışma sayısı 2 0 0 0 MaterniT211,2,3,4 Verifi5,6 Panorama7* *unblinded study 1Ehrich, et al. Noninvasive Detection of Fetal Trisomy 21 by Sequencing of DNA in Maternal Blood: A Study in a Clinical Setting. Am J Obstet Gynecol. 2011 Mar;204(3):205. 2Palomaki, et al. DNA Sequencing of Maternal Plasma to Detect Down syndrome: An International Clinical Validation Study Genet Med. Vol 13:No 11. Nov 2011. 3Palomaki, et al. DNA Sequencing of Maternal Plasma Reliably Identifies Trisomy 18 and Trisomy 13, as well as Down syndrome: An International Collaborative Study. Genet Med. 2012 Mar;14(3):296-305. 4Canick, et al. DNA Sequencing of Maternal Plasma to Identify Down syndrome and Other Trisomies in Multiple Gestations. Prenat Diagn. 2012 Aug;32(8):730-734. 5Sehnert, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem, 2011 Jul;57(7):1042-9. 6Bianchi, et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol, 2012 May;119(5):890-901. 7Zimmermann, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn 2012 Dec;32(13):1233-41. 18

19. Klinik Çalışma& Yayın - Genel Bakış 19 19

20. HarmonyTMPrenatal Test • Cell free fetal DNA’nın (cffDNA) potansiyeli • Harmony ile MPSS’nin karşılaştırılması • Harmony’nin klinik performansı • Harmony’nin klinik uygulaması 20

21. Klinik Performans 6.000’ den fazla hasta çalışıldı (2,000’den fazlasıortalama riske sahip kadın) Yanlış Pozitiflik Oranı Saptama Oranı >99% (231/232) T21 <0.1% T18 >98% (103/105) <0.1% T13 • Harmony ile 10 olgunun 8’i saptandı <0.1% Source: Sparks et al, Prenat Diagn, 2012; Sparks et al, Am J of Obstet and Gyn, 2012; Ashoor et al, Am J of Obstet and Gyn, 2012; Norton et al, Am J of Obstet and Gyn, 2012; Nicolaides et al, Am J Obstet Gynecol 2012;Ashoor et al, Ultrasound Obstet Gynecol 2012.   21

22. 22

23. Harmony Test – Genel Populasyon Taraması • Bağımsız kör çalışma • Hasta populasyonu • 1. trimester gebelikler (11-13.gebelik haftası) • 2.049 kadında genel populasyon taraması Sonuçlar: • Saptama Oranı: • 10/10 olguda trizomisaptanmış (8/8 trizomi 21; 2/2 trizomi 18) • Yanlış Pozitiflik Oranı: • Harmony %0,1 (2/1,939) • 1. trimester taraması %4.5 (87/1,939)* *based on a 1:150 risk cut-off Nicolaides KH et al. (2012) American Journal of Obstetrics and Gynecology 23

24. Risk Skoru Karşılaştırması Trizomi Yanlış pozitif Normal • Her iki figür aynı hasta grubunu (1.949) göstermektedir • Trizomili10 olgu • Trizomili olmayan 1,939 olgu 1. trimester taraması 24 Nicolaides KH et al. (Sept. 2012) American Journal of Obstetrics and Gynecology

25. NIPT’nin Sunduğu Avantajlar Kanıtlanmış • İddaları destekleyen en büyük klinik veritabanı • 100.000 den fazla analizi yapılmış örnek ve birbiriyle tutarlı sonuçlar • Şeffaf, eğitim ve hasta odaklı güvenilir bir organizasyon • Tüm dünya çapında bu alandaki öncü kişilerce desteklenen Güvenilirlik • NIPT için en düşük test ücreti • Sürekli eklenen yeni erişim noktaları ile kolayca ulaşılabilme Erişilebilirlik Kalite • Her test en az 12 ayrıkalite kontrol ölçümünden geçer • İlave olarak, en az 50 laboratuvar performans ölçümü kullanılır 25

26. Test Raporu 26

27. Test Raporu(T21) 27

28. Kişiselleştirilmiş Risk Hesaplaması Risk skoru değerlerinin %99.5’i her iki uçtan birisindedir 28

29. Testin Sunduğu Yenilikler • Harmony test with Y • Y kromozomunun incelenmesini içerir • Fetalcinsiyet* ve Y anöploidisi ile ilgili bilgi verir • Şu anda uygulanabilmektedir • Harmony test with X,Y • X ve Y kromozomlarının incelenmesini içerir • Fetalcinsiyet* ve Y anöploidisi ile ilgili bilgi verir • Mayıs 2013’ten önce uygulanmaya başlanacak 29 • * Sadece Amerika için geçerli olup Türkiye’de kullanımı yasalar gereği mümkün değildir.

30. HarmonyTMPrenatal Test • Cell free fetal DNA’nın (cffDNA) potansiyeli • Harmony ile MPSS’nin karşılaştırılması • Harmony’nin klinik performansı • Harmony’nin klinik uygulaması 30

31. Potansiyel Klinik Uygulama İnvaziv işlemin alternatifi? • NIPT + Ultrason: • NIPT,yaygın fetal trizomileri saptayabilir • Ultrason, diğer genetik hastalıkların bulgularına odaklanabilir Serum taramasına alternatif ? • Diğer genetik hastalıklar ile bağlantılı NT • Tanıda gecikme • İnvazivişlem gerekliliğinin devamı Pozitif tarama sonrası? • NIPT, tanı amaçlı bir test değildir • Diğer kromozom anomalilerini saptayamaz • Mikroarray 1. Norton, M., Brar, H., Weiss, J., Karimi, A., et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: Results of a Multicenter, Prospective, Cohort Study for Detection of Fetal Trisomy 21 and Trisomy 18, Am J Obstet Gynecol. (2012), doi:10.1016/j.ajog.2012.05.021.; 2. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G, et al. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first-trimester population. Am J Obstet Gynecol (2012);207:x.ex-x.ex. 31

32. Beklentilerin Klinik Testler ile Karşılanması Düşünülen Klinik Test Standart bir analiz isteyen hasta NIPT (T21, T18, T13) İnvaziv test ile karyotipleme & mikroarray Fetusun genetik açıdan tam bir analizini isteyen Karşılaştırmalı genetik analiz isteyen hasta Kesin bir bilgi isteyen İnvaziv test ile karyotipleme Sadece endişe edilen anomaliler: T21, T18, T13, ve seks kromozomu anöploidileri (after counseling re: sex chromosome aneuploidy) • Güvenilir bir test isteği: • %1-2* kümülatif yalancı pozitiflik oranı • Mozaisizm için bilinmeyen saptama oranı Genişletilmiş NIPT * eg. verinata health >1.7% 32

33. Fetal Medicine Center (Nicolaides): Uygulama Protokolü CVS • 10 hafta: • Fetus ölçümleri için tarama • cfDNA testi için kan örneği • Kombine testler için kan örneği • 12 hafta: • Detaylı ultrasontaraması • Sonuçların tartışılması • CVS gerekli ise karar verme • + cfDNA testi • Fetal defektler • NT >3.5 mm 33

34. Ürün Profili • Kısa açıklama ve kullanım amaçları: The Harmony Prenatal Test, maternal kanda cell-free DNA (cfDNA) analizi için geliştirilmiş bir laboratuvar testidir • Bu testin amacı, fetaltrizomi 21 (down), trizomi 18 ve trizomi 13 riskini belirlemektir • Test bir tarama testi olup tanı amaçlı valide edilmemiştir • Mozaisizm, parsiyel kromozomal anöploidiler ve translokasyonlar için valide edilmemiştir • Hasta populasyonu:En az 10 haftalık olan ve tekiz gebeliğe sahip kadınlarda uygulanabilir. Çoğul gebeliklerde (ikiz vb) kullanılması uygun değildir • Örnek Gereksinimleri: • Siyah ve kahverengi kan tüpleri içine 2x10ml tam kan alınır • Örnekler alındığı gün gönderilmelidir. • Sonuç oranı: Test edilen örneklerin %96’sında sonuç alınmaktadır • Rapor süresi:7-10 takvim günü 34

35. 35

36. eklentİler: Yedek slidelar 36

37. NIPT – Directed Yöntemlerdeki Farklılıklar Panorama • Maternal kan örneği – 10hf GA • Hedeflenmiş ve efektif • 10 kat daha az sekanslama gerektirir (MPSS yöntemine göre) • 6000’den fazla hastada 5kör çalışma • %4’den az fetal DNA’ya sahip örnek oranı %2-3 • Fetal fraksiyonun %4 ve üstünde olduğu örneklerde raporlama oranı %99 • 100.000 den fazla analizi yapılmış örnek sayısı ile kanıtlanmış bir teknoloji • Maternal kan örneği – ifade edilen 9hf GA (6 örnek <10hf) • Paternal bukkal smear örneği • Hedeflenmiş fakat efektif değil • MPSS ile aynı miktarda sekanslama gerektirir • 166 hastada 1 kör çalışma* • Yayınlamış yayında %12.6 başarısızlık oranı* • Fetal DNAnın %4-8 olduğu örneklerde başarısızlık oranı >% 40* • Sadece maternal kan örnekleri analiz edildiği zaman test performansının ne olduğuna dair yayınlanmış bir veri yok • Sadece lanse ediliyor/NIPT marketinde ispatlanmamış Örnek Gereksinimleri Teknoloji vesekanslama Yayınlanmış data Test performansı *Zimmermann, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn 2012 Dec;32(13):1233-41 37

38. NIPT – Fetal Fraksiyonun Önemi • Hangi NIPT analizi olursa olsun,%4 veya daha fazla fetal fraksiyon mutlaka gereklidir • Test yapılan populasyonun yaklaşık %3’ünde fetal fraksiyon %4’ün altındadır • Neden cfDNA %4’den daha az olabilir? • Gebelik haftası • Maternal kilo • Bilinmeyen biyolojik ve çevresel faktörler 38

39. Fetal cfDNA – Artan Maternal Kiloya Paralel Azalma • Örneklerin %3’ünde NIPT testi için • yetersiz fetal cfDNA • Maternal kilo artışına paralel olarak • azalan fetal cfDNA 39 39 Ariosa lab data

40. Fetal Fraksiyon– Gebelik Haftası İlişkisi 21. Gebelik haftası sonrası: fetal fraksiyon her hafta %1.1 artar 21. gebelik haftası öncesi: fetal fraksiyon her hafta %0.11 artar 40 Ariosa lab data

41. NIPT Performansı -TümNIPT Yöntemleri Chiu et al, 2011; Chen et al, 2011; Ehrich et al, 2011; Palomaki et al, 2011; Bianchi et al, 2012; Sparks et al, 2012; Ashoor et al, 2012; Norton et al, 2012 cfDNA her zaman fetalgenotip ile korelasyon göstermez (plasental mozaisizm, vanishing twin, maternal mozaisizm) * FPR: Yanlış pozitiflik oranı 41

42. Trizomi 18 ve 13 – Plasental Mozaisizm Yalancı negatif ve pozitif sonuçlara yol açabilir • cfDNA plasentadan köken alır • Muhtemelen trophoblastdan • Koryonik villusun direk preperasyonu ile benzer • Fetus ve plasentanın kromozomal yapısı farklı olabilir • 21. kromozom ile karşılaştırıldığında, 13 ve 18 numaralı kromozomlarda daha sık gözlenir 42 Sources: Kalousek et al, Am J Hum Genet, 1989; Wirtz et al, Prenat Diag, 1991; Smith et al, 1999 42

43. T18 ve T13 – Mozaisizm Çalışması American Journal of Human Genetics (1989) • Yöntem • Yaşayabilir fetuslarda ve ve yenidoğanlarda T13, T18, ve T21 • Sitotrofoblast, villöz stroma, koryon, amnion, ve kordon kanı kromozom analizi • Sonuçlar • T21 fetuslarda, sitotrofoblast ve diğer tüm dokular trizomik olarak gözlenmiş • T13 ve T18 fetuslarda, sitotrofoblast hücrelerinin %30’unda trizomi saptanmış Sitotrofoblastların %70’i isenormal (öploid) bulunmuş NIPT’deki yanlış negatifliklerin, fetal gelişimin biyolojisi altında yatan nedenlerden dolayı trizomi 13 ve T18’de ortaya çıkması daha olasıdır 43

44. T21 için NIPT – Tanı Amaçlı Değil • NIPT sonuçları, hastalığın prevalansı göz önünde bulundurularak değerlendirilmelidir Örnek: 1,000 kadın Test güvenliği: %99saptama %0.1yalancı pozitiflik T21 prevalansı: 1/500 2 olguda T21 998 olguda normal(t21 için) Test + Test - Test + Test - 2 0 1 997 %0.1yalancı pozitiflik oranı %99saptama oranı Pozitif test sonuçlarının sadece 2/3’ü doğrudur 44

45. Cinsiyet Kr. Anöploidileri – Genel Bakış • Maternal karyotip -cfDNA analizini etkileyebilir • Annedeki X kromozomunun durumu (mozaisim vb) buna yol açabilir • 47,XXX kromozom yapısına sahip kadınların %90’ını , fazladan bir X kromozomuna sahip olduğunun farkında değildir • Mozaisizm – İki farklı kromozomal yapıya sahip olma (46,XX/45,X gibi) • Maternal mozaisizm – Anne yaşı ile X kromozom kaybı arasında bir ilişki mevcuttur • Fetal mozaisizm – Seks kromozomu anöploidisi saptanan olguların %50’sinde mozaisizm gözlenebilmektedir. Turner Sendromlu (45,X) olgularda, diğer seks kromozomu anöploidilerine göre mozaisizm oranı daha yüksektir.2 1. Nielsen et al. Human Genetics 1991, 87: 81-83. 2. Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Sixth Edition. Robert L. Nussbaum, Roderick McInnes, Willard Huntington. Saunders, 2001. 45

46. Kadınlarda Doğal X Kromozomu Kaybı Cytogenetic and Genome Research (2007) • 665 kadın (0-80yaş arası) • 19.650 hücrede lenfosit kültürü • 1 veya 2 adet X kromozomu varlığının incelenmesi için G-bantlama analizi Kadınlarda; biyolojik olarak meydana gelen düşük seviyedeki X kromozomu kaybı, seks kromozomlarının NIPT’sinde sıkıntılara yol açar 46

47. Seks Kromozomu Anöploidisi için NIPT – Klinik Veri • Benzer sonuçlar ve kör klinik çalışmalar kısıtlıdır1,2 • Diğer yayınlanmış çalışmalar ya kör çalışma değildir ya da kısa raporlar şeklindedir2,3 • Yayınlanmamış çalışmalar4 • Test performansı1-4 • Saptama oranları %66-95 olup geniş güvenlik aralıklarındadır. • Yalancı pozitiflik oranları %1’e yakındır • Mozaik olgulardaki performans bilinmemektedir 1. Jiang et al. BMC Medical Genomics 2012, 5:57; 2. Bianchi et al. Obstet Gynecol 2012, 119:890 ; 3. Zimmerman et al. Prenat Diagn 2012, 32:1; 4. http://www.verinata.com/providers/clinical-data Accessed March 5, 2013 47

48. Geçerli Kurallar ve Standard Uygulama • Seks kromozom anöploidilerininprenatal evrede incelenmesi genellikle standart prosedürler içerisinde değildir. • Gerçekten seks kromozom anöploidileri için bir tarama yapılmasını istiyor muyuz? • Present: detected as consequence of invasive dx for other conditions • Profesyonel topluluklar seks kromozomu anöploidileri için tarama yapılmasını önermemektedir 1. Brun et al. Prenat Diag 2004, 24:213-218. 48

49. Seks Kromozomu Anöploidi Testi – Klinik Değerlendirme • NIPT • Seks kromozomu anöploidilerini destekleyecek klinik datalar ortaya çıkmaya devam ediyor • Küçük klinik çalışmalar • Mozaisizm için testin performansı bilinmiyor • Seks kromozomu anöploidisinin rutin olarak taranmasının önerilmesinden önce ilave bilgilere ihtiyaç bulunmaktadır • Seks kromozomu anöploidilerinde fenotip oldukça değişken olup bazen normal fenotip görülebilir • Test öncesi danışma: • Hizmet veren kurum/kişiler ve hastalar seks kromozomu anöploidilerini anlama zorluğu yaşayabilirler • Yeterli danışma kaynakları bulunmayabilir 49

50. July 2012 50