Peptide semnal

1. Peptide semnal Atunci când o proteină este sintetizată, structura sa secundară sau terţiară se construieşte din nou şi pe măsura transducţiei este eliberată în citoplasmă. Dacă această proteină este destinată pentru a fi în membrane sau organite celulare, partea codantă a ARNm începe printr-o secvenţă de câţiva aminoacizi ca adresă pentru încorporarea acestei proteine în membrane. Peptidele semnal sunt lanţuri formate din câţiva aminoacizi (15-20) situaţi la extremitatea NH2 terminală a proteinelor traduse, semnalând unde trebuie să fie excretată proteina din celulă.

2. Aceste peptide orientează destinaţia proteinelor; încorporate în membrană (RE, AG, plasmalemă, lizozomi) intră în mitocondrii sau sunt exocitate în afara celulelor prin aparatul Golgi. • Fiecare organit prezintă un mecanism de recunoaştere şi încorporare numai a proteinelor necesare şi specifice lui.

3. Această recunoaştere se realizează datorită unei secvenţe de aminoacizi pe care o conţine proteina respectivă, secvenţa semnal, şi a unui receptor specific care recunoaşte proteina şi o internalizează. • După ce proteina a ajuns la destinaţie, secvenţa semnal este eliminată prin digestie proteolitică, iar în cazul receptorului, acesta este eliberat şi reciclat.

6. Poliribozomii şi peptidele semnal • Poliribozomii care se formează pe un mesager conţinând o peptidă semnal, au o evoluţie uşor diferită. • Transducţia se opreşte cu puţin după sinteza peptidei semnal. • Se ştie că peptida semnal interacţionează direct cu membrana reticulului endoplasmatic. • Acest lucru este posibil datorită particulei de recunoaştere a semnalului SRP (Signal Recognition Particle)

7. . SRP este constituit din diferite proteine şi un ARN 7S. Imediat ce interacţiunea peptidei semnal cu SRP apare în afara structurii ribozomilor, şi se leagă cu SRP este inhibată elongaţia. • Traducerea se opreşte până când SRP este recunoscut de un receptor al membranei RE. • Imediat ce această legătură este stabilită ribozomul este legat de ribozomii din membrana RE lângă un complex proteic. • Acesta contribuie la formarea unui canal apos de transport al proteinelor cunoscut sub numele de translocon, prin care proteina nou formată trece în lumenul, apoi în cisternele RE.

8. Deci canalul se deschide şi elongaţia se reia. • La faţa internă a membranei RE o endopeptidază specifică sau peptidaza semnal va secţiona peptida semnal şi sinteza se va desfăşura până la terminare. • SRP se eliberează în citosol şi traducerea este încheiată. • Proteina va fi în final încorporată într-o membrană sau exportată pentru traversarea AG către exteriorul celulei.

9. Adresarea proteinelor către mitocondrii face apel la un alt tip de peptidă de adresare care conduce peptidele prin traversul membranei mitocondriale. • Produşii primari de traducere conţinând peptide semnal sunt denumiţi preproteine, de exemplu preproinsulina, hormonul preproparotidian, etc.

11. Modificări posttransducţionale • Numeroase modificări chimice se produc după încorporarea aminoacizilor în structura primară a proteinei (transducţia); ele se numesc modificări posttransducţionale. • Se disting modificări cotransducţionale care se produc atunci când transducţia se desfăşoară şi când peptidele formate sunt încă ataşate la ribozomul care a construit-o în celule, în organite sau în afara celulei.

12. Astfel de modificări sunt: • Proteoliza: fragmentarea peptidei semnal; • Glicozilare • Acilare • Hidroxilare, etilare, carboxilare • Dezaminarea citozinei • Fosforilare • Legarea unui cofactor: Metal, Flavine, Hem • Blocajul extremităţilor • Se numeşte proteină matură, forma chimică definitivă pe care proteina în momentul în care îşi îndeplineşte funcţia în organism.

13. Organizarea structurală a proteinelor • Lanţurile polipeptidice ale proteinelor se pliază în diferite moduri atât în cadrul propriului lanţ cât şi între lanţurile vecine adică intracatenar şi intercatenar. • Acest mod de pliere este esenţial pentru activitatea biologică a proteinelor şi această organizare complicată este cea care trebuie conservată pe parcursul procedurilor implicate în purificarea proteinelor. • Mult timp s-a considerat că modurile de pliere ale lanţurilor polipeptidice sunt determinate numai la secvenţa aminoacizilor din lanţ. • Astfel s-a stabilit că proteinele având aceeaşi secvenţă a aminoacizilor pot exista în forme diferite de împachetare şi că astfel de plieri pot fi influenţate de prezenţa altor proteine cunoscute sub numele de molecule supraveghetoare tip scufiţă (chaperones).

15. Denaturarea şi renaturarea proteinelor • O proteină care posedă o proprietate biologică proprie, unică, se numeşte proteină nativă şi ea se deosebeşte de proteina ce şi-a pierdut această proprietate şi pe care o numim de aceea denaturată. • O proteină denaturată şi-a pierdut structura tridimensională sau în alţi termeni conformaţia sa. • Denaturarea poate fi reversibilă sau ireversibilă. • Un exemplu de denaturare ireversibilă este cea termică aplicată la fierberea unui ou albuşul oului (albumina) se coagulează astfel ireversibil.

16. Denaturarea reversibilă se poate realiza prin folosirea atentă a unor reactivi ca ureea şi mercaptoetanolul. • Ureea distruge structura apei şi de aceea limitează interacţiunile hidrofobe ale catenelor laterale R şi a resturilor de aminoacizi, ceea ce duce la deplierea şi la disocierea moleculelor proteice. • Mercaptoetanolul reduce legăturile S-S. De aceea la îndepărtarea ureei şi a mercatoetanolului, proteina s-ar putea renatura. • Renaturarea este interpretată ca o dovadă în sprijinul ipotezei că o proteină având o structură primară corectă se va plia în mod spontan conducând la structura unică responsabilă pentru activitatea sa biologică. • Acest fenomen este denumit autoansamblare a proteinei.

17. Astăzi se ştie că renaturarea proteinelor poate fi asistată pe două căi. • Una implică proteina disulfid izomeraza o enzimă care are rolul de a corecta legăturile S-S greşit formate. • A doua cale implică structurile tip chaperone. • Ele se pot defini ca o familie de proteine din clase neânrudite care mediază asamblarea corectă a altor polipeptide dar care nu sunt componente ale structurilor funcţionale asamblate.

18. Ciclul celular • Toate celulele vii urmează fie un un program de diviziune, fie o moarte programată, numită apoptoza. • La celulele eucariote se pot distinge două faze în timpul diviziunii celulare, interfaza perioadă în care celulele cresc şi mitoza, perioada în care nucleul şi restul celulei se divide. • Viaţa celulei se derulează între 2 mitoze. La mamifere această perioadă durează mai puţin de 30 de ore; sunt celule a căror viaţă este foarte scurtă sau foarte lungă.

20. Pe durata acestor 3 ore, celulele traversează 4 faze: • faza G1 unde genomul fiind diploid, fiecare genă este reprezentată în 2 exemplare. Cromatina este accesibilă ARN polimerazelor care realizează transcripţia genelor în ARNm care vor fi traduşi. • Faza S la jumătatea ciclului începe replicarea ADN; ADN –polimeraza va acţiona în jur de 8 ore pentru a recopia în dublură ADN fiecărui cromozom. • În timpul acestei faze transcripţia este inhibată. • Masa celulară creşte continuu în timp ce conţinutul de ADN creşte în faza S şi scade brusc după faza S, astfel că ADN din celulele care nu se divid este constant. • celula intră în faza G2 unde fiecare genă este reprezentată în 4 exemplare.

21. Cromatina este din nou accesibilă ARN polimerazei care reâncepe transcripţia; • survine mitoza care dă naştere la două celule fiice. Fiecare va primi una din copiile identice din ADN fiecărui cromozom şi fiecare genă va fi reprezentată în două exemplare. • Ciclul celular are trei puncte de decizie: la punctul G1, G2 şi la sfârşitul mitozei • Proteina Cdk (proteinkinaza dependentă de cicline) a fost identificată ca principalul reglator al trecerii prin aceste trei puncte.

22. Complexul Cdk prin intermediul kinazelor fosforilează şi activează numai anumiţi factori de transcripţie pentru cicline. • Nivelul ciclinelor în G1 creşte şi sunt asociate cu Cdk complex numit şi CdkG1.

25. Cromatina şi ADN • În cursul fazelor ciclului celular, cromozomii evoluează pentru a pregăti mitoza. • În timpul G1 cromatina este descompactată şi genele se pot exprima. • Fiecare cromozom nu conţine decât o cromatidă. • În timpul S buclele de replicare se deschid şi începe replicarea. În timpul fazei G2 cele 2 cromatide rezultate din replicări sunt legate prin centromerii lor. • Sunt două cromatide pentru un cromozom. În timpul mitozei centromerul se leagă de fusul acromatidic şi pregăteşte separarea. • Cromatina este compactată la maxim; după mitoză, cromatina este decompactată şi genele se pot exprima în fiecare din celulele fiice.

27. Replicare semiconservativă in vivo • ADN se replică în celulă printr-un proces care asigură ca una din catenele parentale să fie prezentă în moleculele fiice, aşa numita replicare semiconservativă. • Această sinteză se produce în faza S (în mijlocul ciclului celular) ca urmare a activităţii ADN polimeraza  şi . • Alte ADN polimeraza participă la repararea ADN lizat (ADN polimeraza ) sau a replicării ADN mitocondrial (ADN polimeraza ).

28. Replicarea semiconservativă • Cele 2 lanţuri de ADN parental în curs de replicare servesc fiecare ca model pentru sinteza noului lanţ. • În acest mod 2 catene în loc să rămânână ansamblate la fiecare sinteză (replicarea conservativă) se separă totdeauna la fiecare ciclu (replicare semiconservativă). • La prima generaţie o catenă a fiecărui dublu helix provine din celula mamă. • La a II-a generaţie nu există mai mult de două catene ADN a celulei mame, 4 dublu helixuri.

30. Enzimele implicate în replicare • ADN este sintetizat de enzime numite ADNpolimeraze, fiecare dintre acestea utilizând dezoxinucleozid trifosfaţi ca substraturi; polinucleotidul este sintetizat în direcţia 5'-3'. Matriţa de ADN este utilizată pentru a direcţiona ordinea bazelor azotate în polinucleotidul nou sintetizat care devine complementar cu ADN parental. • Se cunosc trei tipuri de ADN polimeraze la E. coli. • -ADN polimeraza III , • -ADN polimeraza I • - ADN ligaza • . Fragmentele de ADN sunt legate prin acţiunea enzimei ADN ligaza. Această enzimă joacă un rol atât în sinteza in vivo a ADN, cât şi în repararea unor rupturi monocatenare ale ADN.

32. Rolul ARN în biosinteza ADN • Sinteza oricărei molecule de ADN este iniţiată prin sinteza unui lanţ scurt de ARN, din nou în direcţia 5'-3', folosind nucleozid trifosfaţi (NTPs) ca substrat, prin intermediul unei enzime numită ARN primaza. Enzima este selectivă privind situsul de iniţiere a sintezei. • În catena conducătoare numai o amorsă este sintetizată. • În catena întârziată, sunt implicate multe locuri de iniţiere pe măsură ce catenele de ADN parental se separă. Amorsa ARN este eliminată de ADN polimeraza I şi spaţiile lipsă sunt completate prin acţiunea acestei enzime. Fragmentele sunt unite de ADN ligază. • Acest mecanism duce la probleme legate de replicarea capetelor cromozomiale, numite telomere. Telomeraza rezolvă această problemă.

34. Bucla de replicare la eukariote • Cel puţin 4 ADN polimeraze au fost identificate la eucariote. Acestea sunt denumite prin litere greceşti α şi β sunt implicate în sinteza ADN nuclear, β în reparare şi γ în replicarea ADN mitocondrial. • ADN polimerazele încep sinteza în numeroase puncte de iniţiere. • În urma legării proteinelor specifice, dublul helix se deschide pentru a permite demarajul. Sinteza ADN începe pe amorsa ADN/ARN constituită de ARNprimază şi ADN polimeraza. • Replicarea se desfăşoară într-o direcţie – în acest sens unul din cele 2 lanţuri de ADN (lanţul sens) este parcurs de enzimă în sensul 3-5 (pe catena antisens), ceea ce permite sinteza unui alt lanţ în direcţia 5-3. • ADN ligazele asigură apoi legarea între diferitele fragmente ale ADN nou.

36. Sinteza celeilalte catene (lanţul întârziat) este mult mai complexă deoarece enzima parcurge acest lanţ de la 5-3. • Primaza şi ADN polimeraza  sintetizează o amorsă de 30 nucletoide înainte de zona de replicare şi ADN polimeraza construieşte secvenţe mici de fragmente de ADN în sensul 5-3 (în jur de 200 nucleotide- fragmentele Okazaki). • Ribonucleazele distrug amorsele ARN (fragmentele Okazaki sunt unite între ele prin ADN ligaze).

38. Furca de replicare • Replicarea începe prin separarea celor două catene ale ADN prin helicaze. Fiecare din cele două lanţuri sunt stabilizate prin SSB (single strand baund). • Pe catena directă, urcând de la 3 la 5, o ADN polimeraza  şi ARN primaza sintetizează un lanţ complementar adăugând dezoxiribonucleotide trifosfat la extremitatea 3OH liberă. Un nou dublu helix se formează între lanţul matriţă directă şi noua catenă sintetizată.

39. Pe lanţul întârziat o polimerază, ADN polimeraza  şi ARNprimaza progresează de la 53’. • Pentru a putea sintetiza un lanţ complementar, trebuie ca ARNprimaza şi ADN polimerazei , să fabrice amorse destul de apropiate la câteva sute de nucleotide distanţa pe lanţul matriţă. • Începând de la 3OH a unei amorse ADN polimeraza  sintetizează un fragment Okazaki până când întâlneşte extremitatea 5 trifosfat a amorsei precedente.

41. Topoizomeraza I şi helicaza • -topoizomeraza este capabilă să modifice rularea hidrolizând o catenă de ADN şi reconstituind-o după ce a fost derăsucită local. Înapoia polimerazelor şi topoizomerazelor, are loc reconstituirea dublului helix (împachetarea).

42. Topoizomeraza şi helicaza

43. Primaza. Demararea acţiunii sale are loc la extremitatea 3OH terminală a lanţului ADN Ultima ribonucleotidă a amorsei, legată de catena ADN care serveşte ca model, va constitui punctul de iniţiere a activităţii ADN polimeraza  . • Amorsa este creată pornind de la o polimerază ARN paticulară (fără legătură cu cele de transcripţie), care poate începe prin a sintetiza 10 nucleotide a unui ARN hibrid, folosind un ADN model. Prima nucleotidă a acestei amorse se păstrează, cei 3 fosfaţi se prind la capătul celei de-a10-a dezoxiribonucleotide a ADN polimeraza  şi începe condensarea a 20 dezoxiribonucleotide. • Amorsa va fi construită deci dintr-o catenă mixtă ARN – ADN, din circa 30 nucleotide.

44. ADN ligazele • ADN ligazele sunt enzime care sunt capabile de reconstituirea legăturilor fosfodiester între 3OH şi fosfatul 5 a două nucleotide vecine dintr-un lanţ de ADN. • Ele intervin în replicare pentru a lega ansamblul lanţului ADN sau fragmentelor Okazaki sintetizate de ADN polimeraze. • Intervin de asemenea în numeroase procese de repararea a ADN genomic.

45. AND ligaza

50. Telomerazele • Sinteza lanţului întârziat a ADN, nu se poate face dacă ADN polimeraza atinge extremitatea 3 a catenei matrice. Dacă n-ar avea mecanisme particulare, la fiecare replicare ADN cromozomial ar fi scurtat. • Telomerul sau secvenţa de ADN a extremităţilor cromozomilor, este o secvenţă 5TTAGGG-3 repetat de sute de ori înainte de 3OH final.