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以神经干细胞为载体的帕金森病基因治疗

以神经干细胞为载体的帕金森病基因治疗. 报 告 人：顾 舒 婷 导 师：文铁桥教授. 课题内容提要. 一、研究背景 二、实验设计 三、实验结果 四、结果与讨论. 研究背景. 一 神经变性疾病 — 帕金森病 (Parkinson’s Disease, PD). 1 帕金森病的历史.  我国古代医学的奠基之作 《 黄帝内经 》 中早已对震颤麻痹的症状有所描述。  我国唐代的著名医学家孙思邈在 《 千金方 》 中也曾报道一例震颤麻痹患者。

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以神经干细胞为载体的帕金森病基因治疗

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Presentation Transcript

  1. 以神经干细胞为载体的帕金森病基因治疗 报 告 人：顾 舒 婷 导 师：文铁桥教授

  2. 课题内容提要 • 一、研究背景 • 二、实验设计 • 三、实验结果 • 四、结果与讨论

  3. 研究背景 • 一 神经变性疾病—帕金森病(Parkinson’s Disease, PD) 1 帕金森病的历史  我国古代医学的奠基之作《黄帝内经》中早已对震颤麻痹的症状有所描述。  我国唐代的著名医学家孙思邈在《千金方》中也曾报道一例震颤麻痹患者。 英国医生James Parkinson (1817)，首次提出“震颤麻痹”并对该病进行描述。 PD 是中老年人群中最常见的神经变性病之一,全球超过2%的65岁以上老年人患有此种疾病，影响他们的晚年生活质量。因中枢神经系统神经递质代谢异常所致。 PD 的主要临床表现是静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓、平衡障碍。

  4. 2 PD的主要病理学特征： 1 黑质纹状体通路的多巴胺能神经元变性 2 残存的神经元中出现路易小体(Lewy bodies , LB) William Dauer and Serge Przedborski. Parkinson’s Disease: Mechanisms and Models. Neuron, Vol. 39, 889–909, 2003.

  5. 正常 多巴胺 乙酰胆碱 乙酰胆碱 帕金 森病 多巴胺 3 帕金森病-神经生化的失衡

  6. 4 帕金森病目前的治疗 Drugs that target the degenerating dopaminergic network within the brain work well at least in the early stages of the disease. Unfortunately, with time these therapies fail and produce their own unique side-effect profile, and this, coupled with the more diffuse pathological and clinical findings in advancing disease, has led to a search for more effective therapies——cell transplantation to cure PD. W. -L. Kuan and R. A. Barker. New Therapeutic Approaches to Parkinson’s Disease Including Neural Transplants. Neurorehabil Neural Repair, Sep 2005; 19: 155 - 181.

  7. 二 神经营养因子NT3 • 神经营养因子NT-3(neurotrophin-3) 是与神经结构和功能密切相关的家族蛋白,调控着神经元的发育、生长、分化和生存,对维持神经系统的正常功能承担着重要作用。 • NT3影响背根节、交感神经节、海马、中脑腹侧多巴胺能和脊髓运动神经元的存活。

  8. 三 神经干细胞的应用前景 • 神经干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞。 • 最终产生中枢神经系统的三种细胞:神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞 • 哺乳动物中枢神经系统损伤后，其内源性修复能力是有限的， 因为受损的成年中枢神经系统很难产生新的神经元， 也不能启动功能性轴突再生。尽管诱导内源性中枢神经系统干细胞分化为神经元是可行的， 但就目前的技术水平， 移植可能是修复受损中枢神经系统更为可行的途径。

  9. 1 2 3 在可调控的培养条件下快速体外扩增，满足移植所需的细胞量 在体外使神经干细胞分化成与被移植部位细胞类型与构成相似的细胞群体后再移植 利用神经干细胞经低温冻存、复苏后仍能维持原来生物学特性这一特点，可构建不同类型的神经干细胞库 体外培养的神经干细胞作为移植供体的优点是：

  10. 实验设计 777bp NSCs Transfect NSCs-NT3

  11. 实验结果 • 一 神经干细胞(NSCs)分离培养及NSCs-NT3的建立 • 二 神经干细胞NSCs、NSCs-NT3体外分化情况 • 三 PD大鼠模型建立及移植细胞DiI标记 • 四 PD大鼠移植后的组织切片观察 • 五 PD大鼠移植后的行为学检测

  12. 一 神经干细胞(NSCs)分离培养及NSCs-NT3的建立 1.1原代神经干细胞体外培养 1.2建立神经干细胞NSCs-NT3 图1 神经干细胞球，体外培养7天。 图3 神经干细胞(NSCs)转染质粒pEGFP-C1-NT3，转染24 h后。

  13. 二 神经干细胞NSCs、NSCs-NT3体外分化情况 2.1 NT3在神经干细胞中的表达 481倍 图4 对NSCs和NSCs-NT3中，NT3表达情况分析。

  14. 2.2 NSCs-NT3趋向于分化为神经元 图5 体外培养分化的神经干细胞免疫组化分析。astrocyte marker: GFAP; neuronal marker: NF 17.48% 39.90%

  15. 2.3 NSCs-NT3分化为多巴胺能神经元 图7 NSCs，NSCs-NT3体外分化后基因表达分析。 图6 体外分化为多巴胺能神经元特异性鉴定。TH：多巴胺能神经元

  16. 三 PD大鼠模型建立及移植细胞DiI标记 采用DiI染色 图8 PD大鼠脑组织切片免疫组化检测多巴胺能神经元。 ? 区分移植细胞和宿主细胞 图9 神经干细胞DiI染色体外培养。

  17. 四 PD大鼠移植后的组织切片观察 图11 细胞移植8周后，对PD大鼠脑组织切片荧光观察。 图10 DiI标记神经干细胞体内移植生长情况。

  18. 五 PD大鼠移植后的行为学检测 5.1 APO诱导大鼠旋转实验 图12 PD大鼠细胞移植后APO(0.5mg/kg)诱导旋转实验分析。 从总体上看，移植NSCs-NT3大鼠PD恢复情况好于移植NSCs大鼠

  19. 5.2 大鼠水迷宫实验 第一天：三组之间均没差异 第二天： Vehicle组与NSCs-NT3组出现差异(p<0.05) 第三天： Vehicle组与NSCs组有差异(p<0.05)，Vehicle组与NSCs-NT3组有显著差异(p<0.01) 第四天： NSCs-NT3组与NSCs组表现出了差异(p<0.05) 图13 细胞移植后水迷宫实验训练：寻找平台潜伏期。 细胞移植8周后，NSCs-NT3组的大鼠的空间学习与记忆能力明显优于Vehicle组和NSCs组

  20. 结果与讨论  首次将NT3表达载体pEGFP-C1-NT3转染大鼠原代NSCs，构建成NSCs- NT3，实现了NT3在神经干细胞的过量表达。神经干细胞NSCs-NT3呈现向多巴胺能神经元分化能力。  建立了6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病模型大鼠，免疫组化证实PD模型大鼠脑部的多巴胺能神经元凋亡。并通过阿朴吗啡(APO)旋转实验检测，PD模型建立成功，为帕金森病大鼠建模积累了经验。  通过将DiI标记的NSCs-NT3移植入PD模型大鼠脑部，至少8周后，观察到移植细胞在大鼠移植部位生长与迁移。免疫组化证实移植细胞分化为多巴胺能神经元。

  21. 　对于单侧黑质毁损的模型，同侧的黑质纹状体通路被破坏，纹状体内的神经元失去多巴胺能神经元的支配，其多巴胺受体便处于一种超敏状态；当给予外源性的多巴胺受体激动剂如阿朴吗啡(APO)后，动物损伤侧的反应就强于健侧而无法保持平衡，并向健侧旋转，旋转的频率大致与黑质内的多巴胺能神经元的受损程度一致。因此，我们通过APO旋转实验，证实移植NSCs-NT3大鼠PD恢复情况好于移植NSCs的大鼠。　对于单侧黑质毁损的模型，同侧的黑质纹状体通路被破坏，纹状体内的神经元失去多巴胺能神经元的支配，其多巴胺受体便处于一种超敏状态；当给予外源性的多巴胺受体激动剂如阿朴吗啡(APO)后，动物损伤侧的反应就强于健侧而无法保持平衡，并向健侧旋转，旋转的频率大致与黑质内的多巴胺能神经元的受损程度一致。因此，我们通过APO旋转实验，证实移植NSCs-NT3大鼠PD恢复情况好于移植NSCs的大鼠。 　通过水迷宫寻找平台训练，证实NSCs-NT3改善了大鼠的空间学习与记忆能力，但是作用机制尚不清楚。 已有文献表明，NT3通过调控海马神经形成，改善学习与记忆能力( Kazuhiro Shimazu, et al. Learn. Mem., May 2006; 13: 307 – 315)。本研究在大鼠黑质纹状体区域移植NSCs-NT3后，推测与控制空间学习和记忆能力的海马区域存在某种联系，需要后续实验进一步的研究。 • 　本研究证实了NSCs-NT3对PD模型大鼠具有积极作用。为PD的转基因神经干细胞移植治疗研究提供了理论与实践依据。

  22. 研 究 成 果 • 专利： • 神经干细胞NSCs-NT3在修复神经元损伤中的应用 • 发明人：文铁桥，顾舒婷，毕建清，黄海，姚远 • 申请号：200810037722.9 • 文章： • Luyi Zhang, Shuting Gu, Cuiping Zhao, Tieqiao Wen. Combined treatment of neurotrophin-3 gene and neural stem cells is propitious ti functional recovery after spinal cord injury. Cell transplant, 2007;6(5):475-81. • 2)  Yiqun Yu, Shuting Gu, Hai Huang, Tieqiao Wen. Combination of bFGF, heparin and laminin induce the generation of dopaminergic neurons from rat neural stem cells both in vitro and in vivo. J Neurol Sci, 2007;255(1-2):81-86.

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