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谷氨酸棒杆菌中启动子文库的构建与分析

谷氨酸棒杆菌中启动子文库的构建与分析. 报告人：马雯雯. 内容. 一、背景介绍 二、实验方案 三、预期结果. 一、背景介绍. 代谢工程与合成生物学 基因表达的系统控制是代谢工程与合成生物学研究的主要方面 主要 研究方法： 基因敲除或大量过表达 —— “ All or Nothing ” 存在的问题 ：基因的表达本身可以达到一个连续的水平 目前的研究方法尚达不到完全连续. 这种研究方式是不完整的，需要 实现基因表达的精细 调控.

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谷氨酸棒杆菌中启动子文库的构建与分析

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Presentation Transcript

  1. 谷氨酸棒杆菌中启动子文库的构建与分析 报告人：马雯雯

  2. 内容 一、背景介绍 二、实验方案 三、预期结果

  3. 一、背景介绍 • 代谢工程与合成生物学 基因表达的系统控制是代谢工程与合成生物学研究的主要方面 主要研究方法：基因敲除或大量过表达——“All or Nothing” 存在的问题：基因的表达本身可以达到一个连续的水平 目前的研究方法尚达不到完全连续 这种研究方式是不完整的，需要实现基因表达的精细调控 Alper et al.(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102,12678–12683 K.Hammer et al.(2006) TRENDS in Biotechnology Vol.24 No.2 February 2006 Cur R.Fischer & Hal Alper(2006) TRENDS in Biotechnology Vol.24 No.2 February 2006 Jone Blazeck &Alper.(2012) Biotechnol. J. 2012, 7 Jan Nešvera &Miroslav Pátek. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:1641 – 1654

  4. 基因表达调控 • DNA和染色体水平：基因缺失、基因修饰、基因重排、基因扩增、染色体结构变化。 • 转录水平调控(主要调控方式）：转录起始、延伸、终止均有影响。原核生物借助于操纵子，真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用进行调控。 • 转录后水平调控：主要指真核生物原初转录产物经过加工成为成熟的mRNA，包括加帽、加尾、甲基化修饰等。 • 翻译水平调控：对mRNA稳定性的调控、反义RNA对翻译水平的调控等。 • 翻译后水平调控：蛋白质的剪切、化学修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化等）、转运等。

  5. 启动子 Simple promoter-gene cassettes have been an essential component of the metabolic engineering paradigm since the field was first described , and since that time promoters have become focal points as enabling “parts” for synthetic biology applications. The first line of control for a biosynthetic pathway is transcription and transcript processing, and as such promoters play an essential role in controlling biosynthetic pathways. Jone Blazeck &Alper.(2012) Biotechnol. J. 2012, 7 Bailey, J. E.Science(1991), 252, 1668–1675 Young, E., Alper, H.,J. Biomed. Biotechnol. (2010),130781 Jay D. Keasling, Metabolic Engineering 14 (2012) 189–195

  6. 微生物自身启动子存在的缺点： ①分离与表征困难，且存在基因序列特异性； ②分离出的启动子只能使基因的表达达到某几个水平； ③分离出的诱导型启动子应用受到限制。

  7. 启动子工程 通过改变DNA序列调节启动子起始转录的能力 • 易错PCR • 间隔序列变异 • 杂交启动子 • 转录因子结合位点直接变异 现有方法： JoneBlazeck &Alper.(2012) Biotechnol. J. 2012, 7

  8. 启动子工程应用实例1——易错PCR Alper et al.(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102,12678–12683 Jone Blazeck &Alper.(2012) Biotechnol. J. 2012, 7

  9. Alper et al.(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102,12678–12683 Jone Blazeck &Alper.(2012) Biotechnol. J. 2012, 7

  10. 启动子工程应用实例2——间隔序列变异 Peter Ruhdal Jensen & Karin Hammer(1998) ,BB,VOL. 58, NOS. 2 & 3, APRIL 20/MAY 5, 1998 Jensen, P.R. and Hammer, K. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64, 82–87

  11. 启动子工程应用实例3——转录因子结合位点变异启动子工程应用实例3——转录因子结合位点变异 对毕赤酵母的AOX1启动子的TFBS进行变异，得到跨度为28倍的启动子文库，有少数变异启动子活性高于WT菌株。 Franz S. Hartner et al. Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No.12 e76

  12. 谷氨酸棒杆菌的启动子 • σA因子识别的启动子的保守序列 Jan Nešvera &Miroslav Pátek. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:1641 – 1654 Miroslav Pátek &Jan Nesvera. Journal of Biotechnology 154 (2011) 101–113

  13. -10区： TANANT • -35区 ： TTGNCA • 扩展-10区： GNTANANTNG • +4区： CATGA • -36、-37位： TT • -40至-55区： A+T-rich Jan Nešvera &Miroslav Pátek. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:1641–1654 Miroslav Pátek &Jan Nesvera. Journal of Biotechnology 154 (2011) 101–113 Miroslav Páteket al. Journal of Biotechnology 104 (2003) 311/323 Pavla Vasicova et al. Journal of Biotechnology ,0021-9193/99/$04.0010Oct.(1999), p.6188–6191 Miroslav Pateket al. Microbiology (1996), 142, 1297-1309

  14. 二、实验方案 • 启动子文库活性的分析 • 启动子序列与强度关系模型的构建

  15. 1.启动子文库的构建 ？

  16. 2.启动子强度的表征 • Lac Z • RT-PCR • 荧光蛋白标记 • 抗性标记 • GFP/RFP Monika Knoppovaet al.CurrMicrobiol (2007) 55:234-239

  17. 我的表征方案

  18. 3.1模型的建立 • 目前存在的分析序列与强度关系的方法 • 按照各个影响因素进行分类 未发现启动子强度与各个类别之间的明确关系 • 将启动子分为强弱两类，再统计分析每个位点与强度的关系 ①只能定性预测强度； ②强与弱的人为分类，对结果影响很大； ③某些序列的组合才对启动子强度有影响，单一位点的分析会造成组合信息丢失。 Marjan De Meyet al. BMC Biotechnology 2007,7:34 doi:10.1186/1472-6750-7-34 Peter Ruhdal Jensen & Karin Hammer(1998) ,BB,VOL. 58, NOS. 2 & 3, APRIL 20/MAY 5, 1998 Jensen, P.R. and Hammer, K. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64, 82–87

  19. 偏最小二乘回归法： Y X tn t1 t2 u2 un u1 y1 …… yq x1 ……xp … … n×q n×p 自变量矩阵 因变量矩阵 (1)ti和ui要尽可能大的携带各自数据系统中的变异信息 (2) ti和ui相关程度最大 王惠文，偏最小二乘回归方法及其应用，国防工业出版社（1999） MarjanDe Meyet al. BMC Biotechnology 2007,7:34 doi:10.1186/1472-6750-7-34

  20. PLSR法回归分析49个启动子序列与其强度的关系，42个用于建立回归模型，7个用来验证，其中6个都有较好的拟合效果。 Marjan De Meyet al. BMC Biotechnology 2007,7:34 doi:10.1186/1472-6750-7-34

  21. PLSR的优势 ①提供了一种多因变量对多自变量的回归建模方法，特别是当变量之间存在高度相关性时，其分析结论更加可靠，整体性更强 ②可以有效解决变量之间多重相关性问题，适合在样本容量小于变量个数时的回归建模 ③实现了多种多元统计分析方法的综合，同时实现多元线性回归分析、主成分分析和典型相关性分析 ④与普通最小二乘回归相比避免了对重要变量的删除，与主成分回归分析相比可以排除对因变量无解释作用的噪声。 王惠文，偏最小二乘回归方法及其应用，国防工业出版社（1999）

  22. 3.2启动子文库活性的分析 1.启动子文库在谷氨酸棒杆菌的不同生长时期中的活性分析 分析启动子文库在谷氨酸棒杆菌的整个细胞周期 中的活性变化情况。 2.启动子文库在不同菌株中的活性分析 将启动子文库分别转入大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中，分析启动子文库是否具有菌种特异性。

  23. 超强启动子的构建 • 在所构建的启动子文库的基础上构建一个超强启动子，用于基因的大量过表达。

  24. 三、预期结果 • 1.在谷氨酸棒杆菌中构建出一个强度分布均匀的启动子文库； • 2.根据表征所得数据构建出强度与序列的关系模型，争取可以通过启动子序列预测启动子强度； • 3.发表高质量论文一篇，申请专利一篇

  25. 谢谢！

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