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Organización genética y regulación

Organización genética y regulación. Gen. Gen. ADN. ADN. Presencia de sustrato. Ausencia de sustrato. ARN-Polimerasa. ARN-Polimerasa. ARN. Regulador. Regulador. +. Proteínas. Regulación. ARN-Polimerasa. Gen. ADN. ARN. Ribosomas. Reguladores. Proteínas. Operón. P r o t eí na s.

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Presentation Transcript

  1. Organización genética y regulación

  2. Gen Gen ADN ADN Presencia de sustrato Ausencia de sustrato ARN-Polimerasa ARN-Polimerasa ARN Regulador Regulador + Proteínas Regulación

  3. ARN-Polimerasa Gen ADN ARN Ribosomas Reguladores Proteínas Operón Proteínas Genes

  4. Tra/Rep C H L B J K R F A M T J O C tnpA I G N (Tn4653 ) tnpT S X K B pWW0 tnpS 117 kb G H res B E xylR H tnpA I xylS Operón (Tn4561 ) F upper V Operón D F meta Q G D E D J XhoI C A E EcoRI P A HindIII Tn4653 Tn4651

  5. P. putida mt-2 pWW0 • Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca) • Mutagénesis al azar • Mapeo y localización de los mutantes (secuenciación) • Análisis bioquímico: identificación de gen-función Organización genética xyl U W C M A B N X Y Z L T E G F J Q K I H S R Operón upper Operón meta

  6. Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato - - - - Tolueno + + + + Bencilalcohol + + + + Benzoato - - + + 3-metilbenzoato - - + + Acetato + Tolueno + + + + Regulación de la expresión Determinar actividades en células creciendo en distintos medios: No-sustrato de la ruta (acetato) Sustratos de la ruta upper Sustratos de la ruta meta

  7. Mutante PaW210: TODAS las actividades son inducibles Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta meta Sustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper como a la ruta meta Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato - - - - Tolueno- - - - Bencilalcohol- - - - Benzoato - - + + 3-metilbenzoato - - + + Ruta upper NO es inducible Ruta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta

  8. XylS benzoatos   + xylUWCMABN xylXYLTEGFJQKIH xylR Pu Pm xylS + upper meta Reguladores XylR ?    tolueno Esquema de regulación

  9. Gen marcador desprovisto de promotor propio Promotor xylR E. coli (pKT570, pJLR107) xylS Pm:: ‘lacZ Inductor Actividad -galactosidasa Ninguno - 3-metilbenzoato + Xyleno + E. coli Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas Fusiones transcripcionales Huésped heterólogo (Escherichia coli) • Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta

  10. Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor P. putida (pWW0) 3-metilbenxzoato ninguno xileno Inductor niveles de mRNA de xylS Ninguno 10 3-metilbenzoato 10 Xyleno100 xylS Expresión de XylS en P. putida mt-2 Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS

  11. benzoatos XylS   upper meta Reguladores + xylS Ps2 xylUWCMABN xylXYLTEGFJQKIH Ps1 Pr1 Pr2 xylR Pu Pm + +     XylR    tolueno

  12. benzoatos XylS BenR   32/38 upper meta Reguladores + - - Ps2 xylUWCMABN xylXYLTEGFJQKIH Ps1 Pr1 Pr2 xylR Pu Pm xylS - + - + + + 54 54 70 IHF IHF     XylR    tolueno

  13. A XylR C Reguladores • Activa a los promotores Pu y Ps • Es dependiente de 54 (familia NtrC) • Reprime su propia expresión • IHF activa en Pu y reprime en Ps • En Ps HU es necesaria • Requiere activación por un efector • Represión dependiente de la presencia de otras fuentes de C

  14. CH2OH CH3 CH3 NO2 CH3 A B C D NO2 Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT 1050 1000 90 XylR 180 1900 2900 450 XylR6 1150 2600 3550 3000 XylR49 1500 900 1050 1000 XylR7 150 150 950 450 XylR49-7 70 172 Glu  Lys 85 Pro  Ser 135 Asp  Asn Perfil de efectores

  15. A C C C A Activación de un regulador Regulador XylR Reprimido Deleción ADP + Pi ADP + Pi ATP ATP Activado por el efector (desreprimido) Constitutivo O‘Neill & al., 1998

  16. Cultivo contínuo (limitación de C) Medio rico Expresión de la ruta upper Expresión de la ruta upper Inductor Crecimiento 0.05 0. 5 0.75 Tasa de dilución (h-1) Cultivo contínuo (0.05 h-1) Expresión de la ruta upper C S N P O2 Limitación Represión catabólica Sistema PTS CRC? Otro?

  17. IHF IHF xylS xylR XylR 54-polimerasa 70-polimerasa Elementos que participan en la regulación XylR Activa Reprime IHF Facilita Impide 54 + Efector + ¿ Represor?

  18. 32 38 Expresión de la ruta meta Inductor Crecimiento Extremo C-terminal Extremo N-terminal a1 a2 a3 a5 a6 a7 a4 Reguladores XylS • Activa al promotor Pm • Pertenece a la familia AraC • Es dependiente de 32 y 38 • Requiere activación por un efector

  19. X XylS Pm :: ‘lacZ Efector Actividad Efector Actividad - 39 2FBz 343 Bz 6369 3FBz 6801 2MBz 2724 4FBz 2886 3MBz 13452 2ClBz 141 4MBz 3377 3ClBz 9034 2,3DMBz 6491 4ClBz 2991 2,4DMBz 1737 2,6DClBz 397 2,5DMBz 4093 3,5DClBz 381 2,6DMBz 383 2BrBz 547 3,4DMBz 4630 3BrBz 5372 3,5DMBz 385 4BrBz 1726

  20. Extremo C-terminal Unión del efector Extremo N-terminal Motivo HTH-2 Motivo HTH-1 a1 a2 a3 a5 a6 a7 a4 XylS Pm :: tet • Mutagénesis química de XylS (NTG) • Selección de resitencia a Tetraciclina: - Constitutiva. - Inducible por distintos efectores. • Identificación del residuo mutado

  21. XylS/Pm:lacZ wt 8000 -galactosidase (Miller U) 4000 rpoS rpoH rpoSrpoH 0 0 2 4 6 8 Time (h)

  22. Proteínas desnaturalizadas estress DnaKJ NO estress 32 - + Promotores dependientes de 32 Respuesta HS

  23. Proteínas desnaturalizadas estress DnaKJ 32 + Promotores dependientes de 32 Respuesta HS

  24. PrpoDhs-lacZ -Galactosidase (Miller U) 3-metilbenzoato Respuesta a choque térmico

  25. 38 Fase estacionaria XylS + Pm COOH 32 benzoato HS FtsH CH3 XylR tolueno (XylR) + Pu - 54 Limitación anabólica IHF 70

  26. 100 tolueno 50 % células TOL+ benzoato o-xyl 0 tiempo Consecuencias • Represión catabólica: MEZCLAS • Activación del regulador: INDUCIBILIDAD La inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas: - Enzima(s) no reconocen el sustrato - El regulador no reconocen al inductor, no se activa la ruta • Plásmido Transferible Incidencia sobre otras poblaciones Tol tiene además 2 transposones! Inestable Retrotransferencia

  27. TOL P. putida mt-2 TOD P. putida F1 TOM B. cepacia G4 TBU R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1

  28. PcatB catBCA benzoato cis,cis-muconato XylS     PbenA benABC(DKEF) b-cetoadipato + - +  pcaR catR benR PpcaR PbenR PcatR - + + + + PpcaK pcaK PpcaF pcaF PpcaT pcaTB(DC) PpcaI pcaIJ P. putida mt-2 Cromosoma (ruta orto)

  29. tod R* X F C1 C2 A D E G I H S T B -P P- tolueno   + PtodX todXFC1C2BADEGIH PtodS todST Tolueno dioxigenasa + meta Reguladores P. putida F1 TOD cromosoma

  30. tbm A B C D E F tolueno Tolueno 2-monooxigenasa   + + tbmR tb4m PtbmA tbmABCDEF 54 Regulador Tolueno 4-monooxigenasa Tolueno/benceno 2-monooxigenasa Burkholderia sp. JS150 TOM plásmido

  31. tbu J H I K G F E W D R S A1 U V A2 C T X cromosoma tolueno Operón meta Fenol hidroxilasa Tolueno 3-monooxigenasa Proteína de membrana    tolueno tolueno   JIKGFEW tbu PtbuW + + + + tbuD PtbuD tbuR tbuS tbuX PtbuX PtbuA1 tbuA1UVBVA2CT 54 54 54 70? 54 ANR? meta Fenol hidroxilasa Reguladores Tolueno 3-monooxigenasa + regulador Proteína de membrana Ralstonia pickettii PKO1 TBU B

  32. P. mendocina KR1 T4MO C tmo A B D E F pcuCAB pobA cromosoma Tolueno 4-monooxigenasa p-cresol metilhidroxilasa + p-hidroxibenzaldehído deshidrogenasa p-hidroxibenzoato hidroxilasa

  33. tutB tut E C D ? tdi S R bss D C A B ? reguladores bencilsuccinato sintetasa bbs A B C D E F G H I bcr oah fdx had dch C B A D benzoilCoA reductasa Thauera aromatica K172

  34. Thauera aromatica K172 -P P- tolueno   + PtdiS tdiSR PbssD bssDCAB Reguladores Bencilsuccinato sintetasa

  35. Características de la regulación En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno: INDUCIBLES Reguladores del tipo de 2 componentes Sometidos a represión catabólica Anaerobias facultativas Expresión reprimida en presencia de O2 AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.

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