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实时荧光定量 PCR. (Real time Quantitative PCR ). 专 业： 生物化学与分子生物学 姓 名： 王梦圆 学 号 ： 2013211026. 1、定义 2、概念和原理 3、染料. 定义. 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法。.
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实时荧光定量PCR (Real time Quantitative PCR)
专业： 生物化学与分子生物学 姓名： 王梦圆 学 号： 2013211026
1、定义 2、概念和原理 3、染料
定义 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法。
常规PCR结合电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板准 确定量 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析， 费时费事 无法对扩增反应实时监测
实时荧光定量PCR （Real-time PCR）技术 于1996年由美国Applied Biosystems公司推 出，由于许多情况下，我们所感兴趣的是未 经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我 们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数 或者某一特定基因在特定组织中的表达量。 在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。
Mg2+ Taq DNA多聚酶 或 荧光物质 Mn2+ 模板DNA dCTP dGTP 引物 dTTP dATP 缓冲液 PCR反应混合物
主要亮点 实时 定量 怎样实现实时定量？ 这是应为在PCR反应体系中加入了荧光基 团，利用荧光信号的积累实现实时监测整 个PCR进程，借助RT-PCR仪绘制出的曲线 对起始模板进行定量分析。借助荧光物质示 踪扩增产物量的变化。
RT-PCR中重要概念和原理 扩增曲线： 荧光扩增曲线可以分成四个阶段： 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段 荧光信号线性扩增阶段 平台期
重要概念和定量原理 扩增曲线：
基线:在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号 被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物 量的变化。
荧光阈值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人 为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指 数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光 域值的缺省设置在 3-15 个循环的荧光信号标 准偏差的 10 倍。
荧光阈值 平台期 • 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 • 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 • 真正的信号:荧光信号超过阈值 Lg－liner phase Rn（荧光强度） Threshold Baseline Cycle（循环数）
CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数被称为 CT 值 （ threshold value ）
Rn（荧光强度） Ct值 Ct value Cycle（循环数）
浓度低 浓度高 CT值与模板起始浓度的关系 哪个样品浓度高？ • 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小 • Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。 起始模板差10倍，Ct值差3.3。
染料 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和 非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异 杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针 类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来 指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针 的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易 行。
SYBR Green I染料法——原理 SYBR Green I是一种结合于所有DNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。 SYBR Green I
SYBR Green I 染料法——作用机理 热 变 性 引物退火 延伸反应
SYBR Green I染料法——问题及解决办法 问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生， 也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。 解决办法： 利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点 曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分 非特异扩增。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析 由 SYBR Green I 得到定量结果。
融解曲线分析 融解温度TM
非特异扩增产物 目的基因产物
Taqman探针法——原理 • 5′端标记有报告基团(Reporter, R) • 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) • 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 • Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。TaqMan 探 针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩 增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物 之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端， 而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配 对时，荧光基团发射的荧光因子与 3’ 端的淬灭剂接 近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外 切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂 分离而发出荧光。
分子信标（molecular beacon）——原理 分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记 寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团 与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团 被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过 程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。分子信标的茎环结构 中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一 般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连 接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须 非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成 茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子 信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开而发荧光。
