Cursul IV

1. Cursul IV Stresul oxidativ, semnalizarea celulară şi cancerul

2. Celulele comunică unele cu altele şi răspund la stimulii extracelulari prin mecanisme biologice cunoscute sub denumirea generică de semnalizare celulară sau traducere de semnal. Semnalele trimise la maşina de transcriere responsabilă pentru expresia unor gene sunt transmise la nucleul celular de o clasă de proteine numite factori de transcripţie. Prin legarea la secvenţe specifice ale ADN, aceşti factori reglează activitatea ARN polimerazei II. ROS sunt implicaţi în: vătămarea celulară semnalizarea intracelulară reglarea intracelulară ROS interferă cu expresia unor gene şi cu unele căi de semnalizare.

3. ROS influenţează starea redox a celulei şi în acord cu concentraţia acestora, pot să genereze : a) un răspuns pozitiv (proliferarea celulară) b) un răspuns negativ (stoparea proliferării şi moarte celulară) • ROS sunt mesageri secundari în celulă: • Reglează concentraţia citosolică de ioni de calciu • Reglează fosforilarea proteinelor • Activează unii factori de transcripţie: NF-kB şi factorii din familia AP-1

4. ROS şi ionii metalici inhibă: • Fosfoserin/treonin fosfataze • Fosfotirozin fosfataze • Fosfolipid fosfataze • Prin interacţia cu grupările sulfhidril care sunt oxidate şi formează legături disulfurice intra şi intercatenare. • Aceste modificări structurale afectează conformaţia proteinelor şi stimulează mai multe cascade de semnalizare:

5. Cascadele kinazelor factorilor de creştere • Src/Abl kinazelor • MAPK • PI3-kinazei • Aceste cascade de semnalizare conduc la activarea mai multor cascade de semnalizare: • AP-1 • NF-kB • p53 • HIF-1 • NFAT

7. Semnalizarea cu citokine şi factori de creştere În celule nefagocitice, s-a raportat producerea de ROS, în urma interacţiei dintre citokine şi factori de creştere şi receptorii acestora. Informaţia din exteriorul celulei este transmisă în interiorul acesteia prin calea de semnalizare a MAPK (protein kinaze mitogen-activate). Factorii de creştere: EGF (factorul de creştere epidermal), PDGF (factorul de creştere derivat de la plachete), VEGF (factorul de creştere al endoteliului vascular)

8. Citokinele care semnalizează cu ajutorul ROS: TNF-alfa (factor de necroză tumorală) IFN-gama (interferon) IL-1 beta (interleukină) Receptorii pentru citokine nu prezintă activitate kinazică intrinsecă şi interacţionează direct canalele ionice sau proteinele G.

9. Anormalităţi în funcţionarea receptorilor factorilor de creştere sunt asociate cu dezvoltarea multor tipuri de cancere. Receptorii pentru EGF, PDGF, VEGF, sunt afectaţi de metalele carcinogenice: nichel, arsenic, cobalt, beriliu. Nichelul creşte expresia receptorilor EGF iar supraexpresia receptorului EGF a fost observată în cancerul de plămân şi al căilor urinare. VEGF este indus de Co, Ni, As şi hipoxie şi este implicat în proliferare şi angiogeneză Activarea EGF şi VEGF a determinat creşterea calciului celular. Supraexpresia PDGF s-a observat în cancere de plămân şi prostată.

10. Tirozin kinazele fără funcţie de receptor Aceste enzime sunt din familia Src (Src kinaze) şi a kinazelor Janus (JAK) şi sunt activate de ROS. Src este activată de As(III) şi compuşi ce conţin Cr(III) organic, radiaţii UV şi de o serie de ROS. Supraexpresia Src se înregistrează în cancerul colorectal, de sân, pancreas, vezică, etc. Moleculele Src activate se leagă la membrana celulară prin miristoilare şi iniţiază cascadele de semnalizare MAPK, NF-kB şi PI3K

11. Proteinele Ras • Proteine G monomerice legate de membrană care au ca funcţii principale: reglarea creşterii celulare şi contracararea efectelor apoptozei • Activate de: radiaţii UV, ROS, metale şi stimuli mitogeni • As, Ni, Fe, şi Be induc mutaţii ale genelor ras • Mutaţii ale acestor gene se înregistrează în 30% din cancerele de plămân, piele, ficat, vezică şi colon • Compuşii cu Ni(II) induc tumori de rinichi în şobolani • Mutaţii ale ras cauzate de metale nu s-au raportat la cancere umane

12. Protein tirozin fosfatazele (PTP) • Inactivarea reversibilă a PTP de către ROS joacă un rol important în controlul redox şi semnalizarea celulară • Sunt oxidate resturile de cisteină din centrul catalitic activ al PTP • Apa oxigenată şi anionul superoxid reacţionează cu resturile de cisteină, generând intermediari acid sulfenic, care ulterior interacţionează cu grupări tiol, formând disulfuri PTP inactive

13. Serin-treonin kinazele • Serin-treonin kinazele receptor din celule de mamifere sunt membri ai superfamiliei TGF-beta1 • Inhibă în general creşterea celulară, stimulează producerea de ROS şi supresează expresia enzimelor antioxidante din unele tipuri de celule (hepatocite de şobolan) • Sunt activate de ioni de calciu, eliberaţi din situsurile de stocare celulară sub acţiunea ROS

14. Akt • Este o serin-treonin kinază recrutată în celulă de PI3k şi activată prin fosforilare • Activarea sa stimulează creşterea celulară şi inhibă apoptoza • Inhibarea sa stimulează apoptoza • Activarea VEGF de către ROS se realizează prin calea PI3K/Akt în celule musculare de şoarece

15. PKC • Conţine domenii catalitice şi reglatoare susceptibile la modificări oxidative induse de ROS • Conţine mai multe regiuni bogate în resturi de cisteină, atât în motivele zinc-fingers din domeniile reglatoare, cât şi în domeniul catalitic care pot fi modificate cu oxidanţi diferiţi. • Prin tratament cu apă oxigenată, PKC este activată • Un mecanism posibil de activare este fosforilarea unui rest de tirozină şi trecerea la o formă independentă faţă de calciu şi lipid • Activarea PKC indusă oxidativ joacă un rol critic în proliferarea malignă şi în căile de semnalizare downstream şi anume activarea MAPK, a unor factori de transcripţie şi protooncogene

16. MAPK • ERK (Kinazele reglate extracelular) • JNK (kinaza c-jun NH2 amino terminală) • P38 MAPK • BMAPK-1 (big MAPK-1) Disfuncţii ale MAPK au fost observate în cancerele de piele, sân şi cervix

17. Balanţa dintre activarea ERK şi JNK este factorul cheie pentru supravieţuirea celulară; o descreştere în activitatea ERK şi o creştere în cea a JNK este necesară pentru inducerea apoptozei. • As(III) şi Cr(VI) activează ERK1 şi ERK2, JNK şi p38 în cancerul de sân • BMAPK-1 nu este activată direct de ioni metalici ci indirect prin peroxid de hidrogen

18. Factorii de transcriere nucleari • Aceştia controlează expresia genelor: • de protecţie ai căror produşi repară ADN modificat • care fortifică sistemul imun • care stopează proliferarea celulelor lezate • care induc apoptoza

19. Aceştia sunt: • NF-kB, implicat în răspunsul inflamator • AP-1, implicat în creştere şi diferenţiere • p53, care este gardianul ciclului celular • NFAT (factorul nuclear al celulelor T activate), care reglează formarea citokinelor, diferenţerea şi creşterea celulelor musculare, angiogeneza şi adipogeneza • HIF-1 (factorul indus de hipoxie), reglează expresia multor gene implicate în cancere, care codifică: VEGF, hem-oxigenaza 1 şi lactat dehidrogenaza A

20. AP-1 • Sub această denumire se cunosc o colecţie de proteine dimerice cu motive leucine zipper care aparţin subfamiliilor Jun (c-Jun, JunB, JunD), Fos (Fos B, Fra-1, Fra-2), Maf, şi ATF, care, toate, se pot lega la un agent de promovare tumorală (TPA) sau la elemente responsive la cAMP. • Este indus în urma expunerii la unele metale în prezenţa peroxidului de hidrogen, la alte stresuri fizice, chimice şi la citokine, proces mediat în principal de cascadele JNK şi p38 MAPK • Agenţii de stres activează cele două căi fie: prin intermediul ASK-1 (apoptosis signal-regulating kinase), fie prin inhibiţia MAP kinaz fosfatazelor

21. Efectele activării AP-1 • Creşterea proliferării celulare • S-a demonstrat că c-Jun şi c-Fos sunt reglatori pozitivi ai proliferării celulare iar expresia lor poate fi indusă de: diferite metale, CCl4, fenobarbital, alcool, radiaţii ionizante, azbest • Inhibiţia apoptozei;raportul inducere /inhibiţie este dependent de • Balanţa dintre genele ţintă pro şi antiapoptotice • Stimulul folosit • Durata stimulului

22. NF-kB • Este un factor de transcripţie inductibil şi ubicuitar exprimat care acţionează asupra genelor implicate în supravieţuirea celulară, proliferare, angiogeneză, diferenţiere, inflamaţie şi creştere • Interacţionează cu domeniul enhancing al genei ţintă fiind sub forma unui dimer alcătuit din doi membri ai familiei de proteine NF-kB/Rel/Dorsal (NRD). Există 5 membri NRD cunoscuţi : RelA (p65), cRel, RelB, p50 (NF-kB1), şi p52(NF-kB 2) • Dimerul clasic este RelA-p50 (dintre toţi doar RelA prezintă un domeniu de transactivare)

23. În celulele nestimulate, NF-kB se găseşte în citoplasmă datorită interacţiei cu o familie de inhibitori proteici (IkB). Activarea NF-kB se produce ca răspuns la o serie de stimuli extracelulari care determină disocierea IkB şi eliberarea secvenţei de localizare nucleară care permite intrarea NF-kB în nucleu şi legarea la elementele de reglare kB. Promotori tumorali: metale toxice, radiaţii UV, forbol esteri, azbest, alcool, benzopiren, etc. Activarea NF-kB: leucemii, cancere de colon, sân şi pancreas. Nu se cunoaşte mecanismul prin care metalele produc activarea NF-kB

24. p53 • Este considerată represor tumoral pentru că opreşte ciclul celular şi iniţiază apoptoza atunci când celula este lezată • Mutaţii la acest nivel sunt înregistrate în diferite tipuri de cancere • Prezintă în domeniul central mai multe resturi de cisteină care sunt critice pentru legarea proteinei la ADN • Supraexprimarea p53 conduce la creşterea nivelului de ROS şi determină apoptoza prin activarea ferrodoxin reductazei şi REDD/HIF-1.

25. Cr (VI)induce activarea p53 la nivel translaţional. Aceasta se produce prin fosforilarea şi acetilarea la nivelul Ser 15 şi Lys 383. • Cr (VI) poate induce indirect apoptoza mediată de p53 în multiple moduri: • Prin lezarea ADN • Prin legarea la ADN a produşilor de reducere a Cr(VI) • Prin activarea MAPK înainte (upstream) de p53 • Prin activarea directă a p53 • Prin amplificarea efectelor altor carcinogeni

26. Efectul As(III) asupra p53 nu este clar. Expunerea la nichel produce alterarea structurii genei p53în celule epiteliale umane. Un alt mecanism prin care metalele pot afecta structura p53 este prin substituţia zincului, care este esenţial pentru interacţia p53 cu ADN. După expunerea la NO s-au observat mutaţii la nivelul p53. S-a observat o asociere între creşterea expresiei iNOS şi tranziţia G:C la A:T în p53 în cazul cancerelor de stomac, creier şi sân. NO este iniţiator endogen şi promotor în carcinogeneza umană.

27. NFAT • Este activat de calcineurină, care este activată de nivele ridicate de calciu • O serie de metale ridică nivelul de calciu intracelular (vanadiu, nichel, fier) • Vanadiul activează NFAT şi prin generare de apă oxigenată

28. HIP-1 • Este un heterodimer • Reglează expresia multor gene implicate în cancer, care codifică: VEGF, aldolaza, enolaza, LDH A şi altele • Hipoxia şi peroxidul de hidrogen sunt principalii inductori • Este indus de expunerea la Ni, pentru că, probabil, acesta înlocuieşte fierul din hemoglobină • Este implicat şi în reglarea genelor implicate în transportul glucozei şi glicoliză

29. Mecanismul carcinogenezei • Este un proces multisecvenţial care produce transformarea unei celule sănătoase într-una precanceroasă şi în final în una canceroasă • Teoria veche: o boală a diferenţierii celulare, se considera că boala începea la nivelul unei singure celule • Al doilea mecanism: o creştere a sintezei ADN şi a mitozei cu ajutorul carcinogenilor non-genotoxici poate induce mutaţii în celulele ce se divid prin incapacitate de reparare. Mutaţiile se amplifică favorizând trecerea de la o stare pre-neoplazică la una neoplazică

30. Al treilea mecanism ia în considerare echilibrul între proliferare şi moarte celulară. Dacă lezarea ADN este prea extinsă se produce apoptoză, pentru că p 53 verifică integritatea ADN şi declaşează mecanismele care determină eliminarea defectelor, iar dacă nu se poate realiza, declanşează apoptoza. Circa 50% din cancere sunt declaşate de defecte upstream sau downstream faţă de p53. • Al patrulea mecanism ia în considerare comunicarea la nivelul joncţiunilor gap. Există gene care atunci când sunt activate (oncogene) sau inactivate (supresoare tumorale) contribuie la expansiunea clonală a unei celule stem. Multe celulele tumorale cu oncogene activate au joncţiuni gap disfuncţionale. De aici s-a dedus o legătură între activarea oncogenelor şi comunicarea intercelulară la nivelul joncţiunilor gap.

31. Carcinogeneza este un proces multi stadial: • Iniţiere • Promovare • Progresie • Cea mai recentă teorie este cea integrativă : “cancerul ca o boală a homeostaziei”. • Agenţii care interferă cu boala pot fi: • genotoxici, care lezează ADN • epigenetici (non-genotoxici), care nu interacţionează direct sau indirect cu ADN, care modulează creşterea şi moartea celulară şi al căror mod de acţiune nu este complet cunoscut

33. ROSpot acţiona la toate cele trei stadii ale carcinogenezei. Iniţierea implică mutaţii neletale în ADN care sunt fixate în urma cel puţin unei replicări . Dacă celule sunt lezate dintr-un motiv sau altul, pot întrerupe ciclul celular. Studii pe tumori benigne au dovedit existenţa unei directe corelaţii între cantitatea de aducţi cu 8-OH-G şi mărimea tumorii; nivelul de 8-OH-G poate determina transformarea unei tumori benigne într-una malignă. Iniţierea continuă cu modificările nivelului ionilor de calciu induse de stresul oxidativ.

34. Promovarea este caracterizată de expansiunea clonală a celulelor iniţiate prin inducerea proliferării celulare şi/sau inhibării apoptozei. Se formează o leziune focală, care necesită prezenţa continuă a unui stimul de promovare tumorală, şi de aceea este un proces reversibil Stresul oxidativ la nivel ridicat, induce moarte celulară, iar la nivel scăzut stimulează diviziunea celulară. Producerea de ROS în acest stadiu este principala modalitate de promovare a tumorilor

35. Progresia implică modificări celulare şi moleculare care conduc la trecerea de la starea preneoplazică la cea neoplazică. Este ireversibilă şi este caracterizată de acumulare de material genetic adiţional, ceea ce conduce la tranziţia celulei de la starea benignă la cea malignă. Este caracterizată de instabilitate genetică şi distrugerea integrităţii cromozomilor. Pentru creşterea tumorii peste câţiva mm este nevoie de aprovizionare cu sânge, deci de angiogeneză. Angiogeneza implică : degradarea membranei bazale, migrarea celulelor endoteliale spre stroma perivasculară şi împrăştierea capilarelor.

36. Mecanismele de protecţie antioxidantă în carcinogeneză • Un antioxidant bun trebuie să: • inactiveze specific radicalii liberi • Chelateze metalele redox • Regenereze alţi antioxidanţi • Aibă un efect pozitiv asupra expresiei genice • Fie absorbit repede • Aibă o concentraţie relevantă din punct de vedere fiziologic în ţesuturi şi fluide biologice • Acţioneze în mediu apos şi/sau domenii membranare

37. Antioxidanţii enzimatici Cei mai eficienţi sunt: SOD, CAT, GPX

38. SOD (EC 1.15.1.1.) La oameni există trei tipuri: citosolică, Cu,Zn-SOD, de 32 kDa, homodimerică, fiecare subunitate are un situs catalitic activ ce conţine un cluster constituit din ioni de Cu şi Zn Mitocondrială, Mn-SOD este un homotetramer, 96 kDa, conţine câte un ion de Mn per subunitate, care oscilează de la Mn(III) la Mn(II) şi înapoi la Mn(III) în timpul reacţiei de dismutare. Are activitate antitumorală şi supraexpresia sa întârzie creşterea tumorilor.

39. Expresii foarte ridicate de Mn-SOD sunt corelate cu prognostice proaste, stadii avansate ale progresiei bolii şi cu un fenotip invaziv şi metastatic. Supraexpresia Mn-SOD determină activarea MMP 1 şi 2, implicate în remodelarea tisulară şi invazia tumorală, probabil prin intermediul AP-1 şi NF_kB care sunt stimulate de concentraţii mari de peroxid de hidrogen Extracelulară (EC-SOD) Ni-SOD-Streptomyces

40. CATALAZA (EC 1.11.1.6) • Peroxizomi • O moleculă catalizează descompunerea a 6 milioane de molecule de peroxid de hidrogen • Descreşterea activităţii în o serie de tumori

41. GPX • Două tipuri: Se-dependentă (EC 1.11.1.19) Se- independentă (GST EC 2.5.1.18) • La om există patru tipuri deferite de GPx Se-dependente Competiţionează cu catalaza pentru peroxidul de hidrogen şi este sursa majoră de protecţie în cazul nivelelor mici de stres oxidativ