Electroforesis o cataforesis

1. Electroforesis o cataforesis • Es el movimiento de moléculas o partículas cargadas en un campo eléctrico • Se puede realizar con propósitos analíticos de identificación o para caracterización física de los componentes de una muestra o para su separación preparativa. • Se usa para analizar y separa moléculas (ej. proteínas) o para depositar recubrimientos, como en los elementos usados en los tubos de electrones.

2. Electroforesis o cataforesis • La migración electroforética de una molécula puede realizarse dentro de cualquier medio pero generalmente es una matriz. • Si el fluido es el que se pone en movimiento, por ejemplo a través de un diafragma fijo, se le llama electroósmosis.

3. Movimiento de moléculas en la electroforesis • Las moléculas siempre se mueven hacia el electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de la molécula (los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo). • El medio necesita estar amortiguado al pH que produce la dirección y taza apropiada de migración.

4. Electroforesis cátodo – (–) – – + + – + – – (+) ánodo

5. Movilidad y pI • Las movilidades de las proteínas se incrementan proporcionalmente al alejamiento de sus puntos isoeléctricos ya que se incremente su carga neta. • Los ácidos nucleicos y las proteínas en presencia de SDS presentan movilidades más altas en un rango de pH arriba de la neutralidad.

6. Factores que afectan la movilidad electroforética • Composición del solvente • Presencia de detergentes • Temperatura • Fuerza iónica • Ejemplos: la estabilidad de los ácidos nucleicos depende de los iones Na+ • Las proteínas se agregar a bajas fuerzas iónicas • Altas fuerzas iónicas pueden sobrepasar la disipación de calor de Joule del aparato de electroforesis

7. Invención • El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937 • Desarrolló la “moving boundary”, que se convertiría en la electroforesis zonal y la utilizó para separar proteínas del suero.

8. Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-71) • Tesis (1930): The moving-boundary method of studying the electrophoresis of proteins" (publicado en Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis, Ser. IV, 7, No. 4) • (1937) A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Transactions of the Faraday Society, 33 524.

9. Tubo de Tiselius Ánodo Cátodo – + Amortiguador Límite o frontera ascendente Fronteras iniciales Límite o frontera descendente Moléculas de proteína

10. Desarrollo • La electroforesis se desarrollo completamente de los años 40s a los 50s. • Se utilizó para separar moléculas que van desde las proteínas más grandes, aminoácidos y hasta iones inorgánicos.

11. Aplicaciones • Bioquímica • Química clínica, forense, de alimentos • Toxicología • Farmacia, farmacología • Enzimología, inmunología • Microbiología, • Botánica, citología, • Biología Molecular, etc.

12. Electroforesis zonal • Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta entre proteínas (carga total/masa). • Este método se denomina electroforesis zonal.

13. Además de la electroforesis zonal, se desarrollaron dos otros tipos: • Isoelectoenfoque e isotacoforesis. • Estos tres métodos se basan en propiedades físicas diferentes. • Es posible hacer tres análisis separados sobre una misma muestra o los métodos se pueden combinar.

14. Diversificación de soportes • Los soportes o matrices sobre los que se ha realizado la electroforesis se ha diversificado durante el tiempo de desarrollo de la electroforesis. • Se ha observado que diferentes matrices dan diferentes ventajas para diferentes tipos de muestras. • Algunas matrices utilizadas han sido geles de polímeros, papeles o capilares.

15. Papel • Fue el primer soporte usado en las técnicas de electroforesis desarrolladas para separar compuestos (Tiselius, 1937). • Es fácil de usar porque no se requiere preparación de la matriz. • Es limitada su capacidad resolutiva. • En 1957, Kohn usó acetato de celulosa como medio de soporte. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.

16. Almidón • Smithies usó un gel de almidón como medio para electroforesis en 1955. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.

17. Capilares • Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares como matrices para la electroforesis a principios de los 1980's. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

18. Poliacrilamida • En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y Weintraub utilizaron geles de poliacrilamida. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.

19. Velocidad de migración • Es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. • Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración.

20. EQ V = F V Q Movilidad = = m = E F Velocidad y movilidad de las moléculas en una electroforesis V, velocidad E, campo eléctrico Q, carga neta F, coeficiente de fricción

21. Poliacrilamida • Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente formador de enlaces cruzados (“cross-linking”), la bis-acrilamida.

22. Reacción de polimerización • La reacción se desencadena por la presencia de un iniciador y se continua con ayuda de un catalizador. • El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se añade en forma de persulfato amónico (APS). • Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilendiamina). • En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean otros sistemas catalizador-iniciador.

23. Oxígeno y polimerización • El oxígeno es un inhibidor de la polimerización de la acrilamida, por lo que • Las soluciones de acrilamida se desgasifican para que la polimerización sea completa y a con buena velocidad. • Además, durante la polimerización se libera calor (reacción exotérmica), lo que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel.

24. La velocidad de polimerización es proporcional a la concentración de persulfato (iniciador) y TEMED (catalizador) adicionados.

25. La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida • Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use. • El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel. • Los geles se denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. • La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 15%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.

26. = S2O8 . . SO4 SO4 O O = CH2 CH C NH2 = = NH2 CH2 CH C . Radicales libres en la polimerización de la acrilamida Persulfato Sulfato radical libre + Acrilamida radical libre Acrilamida

27. Enlace acrilamida - bisacrilamida O C CH2 CH CH2 CH2 C O CH2 CH2 O C C C CH2 CH2 C CH2 O CH2 CH2

28. Estructura de la poliacrilamida

29. Ventajas de los geles de poliacrilamida • Químicamente inertes, • Transparentes • Estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.

30. CH2 N (CH2)n CH2 (CH2)n CH2 (CH2)n CH2

31. a + b %T = X 100% m b %C = X 100% a + b Relaciones %T y %C a = acrilamida (g) b = N,N’-metilenbisacrilamida m = volumen final (ml)

32. C, es crítica si es menor a 10 los geles son rígidos y opacos si excede 100 en geles con 5 % de acrilamida son pastosos y se rompen. • Geles elásticos y completamente transparentes se obtienen con C de 30 y con acrilamida superior al 3%

33. No hay gelificación si la acrilamida es menor al 2% y la Bis menor a 0.5%. • Para que los geles sean elásticos la concentración de bisacrilamida debe disminuir. Puede usarse la fórmula : C = 6.5 - 0.3T en un rango de 5-20% de acrilamida

34. Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando encuentran en un campo eléctrico.

35. Electroforesis nativa • Las proteínas se someten a una migración sin desnaturalización. • Las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma. • Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre subunidades y entre proteínas. • Los sistemas amortiguadores (tampón) usados son : • tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), • tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y • tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

36. Electroforesis desnaturalizante • Somete a las proteínas a migración asegurando su desnaturalización completa (pérdida de la estructura tridimensional). • La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. • El agente desnaturalizante más empleado es el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

37. Sistemas de amortiguadores • Se puede realizar empleando sistemas de uno o más amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas amortiguadores continuos o discontinuos. • En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer gel asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocando la acumulación de todas las que se han cargado en el pozo. • La separación realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración alcanza la frontera del segundo tampón.

38. PAGE • La electroforesis de proteínas en geles en una matriz de poliacrilamida es denominada electroforesis en poliacrilamida o PAGE, (“PolyAcrilamide Gel Electrophoresis”). • Es una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. • Es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra, pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.

39. PAGE -SDS • Su nombre significa Electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS (“SDS-polyacrilamide gel electrophoresis”). • PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada. • Descrita por Laemmli (1970, Nature, 277:680)

40. PAGE -SDS • Electroforesis desnaturalizante • Las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes: • beta-mercaptoetanol, destruye los puentes disulfuro, • SDS, desnaturaliza y recubre a la proteína y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

41. PAGE -SDS • Se emplea un sistema de dos tampones (discontinuo). • Permite la separación de volúmenes relativamente grandes de muestra sin pérdida de resolución. • La concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking').

42. PAGE -SDS • El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en que: • los iones glicinato, cargados negativamente de manera incompleta (en el amortiguador superior) tienen una movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínas-SDS, • Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que los iones Cl- del amotiguador de muestra en el gel de compactación (“stacking”).

43. PAGE -SDS • Cuando se someten las proteínas a el campo eléctrico todas las especies deben migrar a la misma velocidad para mantener el circuito eléctrico. • Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Cl- si hay una región de con un gradiente de alto voltaje. • El gradiente es inversamente proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la concentración.

44. PAGE -SDS • El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que [Cl-] > [proteína-SDS] > [glicinato-]. • Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS este complejo se concentra en una banda muy delgada entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato-. • Cuando el glicinato- alcanza el borde del gel de separación adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH superior, e incrementa su movilidad. • A partir de ese momento la interfase entre el glicinato- y el Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se desplazarán a su propia velocidad.

45. SDS • Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, lauril-sulfato de sodio. • Detergente aniónico • Desnaturalizante • Se une a las cadenas polipeptídicas con una relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena.

46. SDS • La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína • Le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa. • Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan hacia el ánodo.

47. SDS • La separación de los complejos SDS-proteína es • proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. • Se puede determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. • Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

48. Inicio de la PAGE discontinua Muestra Tris-HCl, pH 6.8 Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3 Al inicio de la electroforesis, las muestras se colocan en un pozo. El volumen puede ser variable en cada muestra aunque la cantidad de proteína debe ser constante. - Gel de compactación Tris-HCl, pH 6.8 Gel de resolución Tris-HCl, pH 8.8 + Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3

49. Compactación (“stacking”) Las proteínas se focalizan (compactan) formando una banda delgada El primer gel o gel de compactación (“stacking”) es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel.

50. Separación en el gel resolutivo. El segundo gel, o gel de resolución, es el que realmente separa a las proteínas. Presenta un poro menor y un pH de 8.8. Proteínas fraccionadas en el gel de separación Frontera Glicina/cloruro