НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу

1. НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу Розробка технології інтерферонів І типу з використанням конструктивно оформленої індукторної системи багаторазової дії к.т.н., доц. Пенчук Ю.М., Київ 2007

2. Мета дослідженняМетою роботи є розробка нової технології отримання препаратів ІФН І типу з використанням комплексної індукторної системи дріжджова РНК-гідрохлорид тилорону, іммобілізованої на нерозчинному носії. Задачі дослідження: • конструювання штучних конструкцій для здійснення процесу індукції ІФН І типу (α/β-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону (ІММК); • дослідне визначення кількісних та часових параметрів синтезу ІФН клітинами-продуцентами під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування; • розробка та конструювання установки для отримання ІФН в умовах in vitro з використанням моношарових та суспензійних клітинних культур, індукованих за допомогою ІММК; • експериментальна оцінка ефективності інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК за різних технологічних умов, оптимізація параметрів біосинтезу ІФН в дослідній установці, як прототипі промислової апаратури, з застосуванням ІММК у якості інтерфероногену.

3. А Б А Б СХЕМА КОНСТРУЮВАННЯ ІНТЕРФЕРОНІНДУКУЮЧИХ МОЛЕКУЛЯРНИХ КОМПЛЕКСІВ А - утворення інтерфероногенних дволанцюгових ділянок у складі одноланцюгової РНК під дією зв’язування з тилороном; Б - конструювання часток ІММК

4. ВМІСТ РИБОПОЛІНУКЛЕОТИДІВ У ПРЕПАРАТАХ ІММК, СТВОРЕНИХ НА ОСНОВІ РІЗНИХ ГРАНУЛЯРНИХ НОСІЇВ

5. ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ ІММК НА ОСНОВІ СФЕРОНУ, А ТАКОЖ ЙОГО ОКРЕМИХ КОМПОНЕНТІВ, НА ЛЕЙКОЦИТИ КРОВІ ЛЮДИНИ

6. ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ РІЗНИХ ІММК НА МОНОШАРОВІ КУЛЬТУРИ КЛІТИН

7. РІВНІ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ В МОНОШАРОВИХ КУЛЬТУРАХ КЛІТИН ПІД ДІЄЮ РОЗЧИННИХ ТА ІММОБІЛІЗОВАНИХ ІНДУКТОРІВ

8. 1 2 3 КІНЕТИКА НАКОПИЧЕННЯ ІФН ПІД ІНДУКТОРНОЮ ДІЄЮ ІММК МОНОШАРОВИМИ КЛІТИННИМИ КУЛЬТУРАМИ: 1 – ПТП; 2 – L41; 3 – L929

9. 1 2 ЗМІНА ПАРАМЕТРІВ ІММК НА БАЗІ СФЕРОНУ У ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД КІЛЬКОСТІ ЦИКЛІВ РЕГЕНЕРАЦІЇ. 1 – ІНДУКТОРНА АКТИВНІСТЬ ІММК; 2 – ВМІСТ РНК

10. ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ РІЗНИХ ІММК В УМОВАХ СУСПЕНЗІЙНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ

11. РІВНІ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ В СУСПЕНЗІЙНІЙ КУЛЬТУРІ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ ПІД ДІЄЮ РОЗЧИННИХ ТА ІММОБІЛІЗОВАНИХ НА СФЕРОНІ 300 ІНДУКТОРІВ ПОЛІНУКЛЕОТИДНОЇ ПРИРОДИ

12. КІНЕТИКА НАКОПИЧЕННЯ ІФН СУСПЕНЗІЙНОЮ КУЛЬТУРОЮ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ ЗА ІНДУКТОРНОЇ ДІЇ ІММК

13. ЗАГАЛЬНИЙ ВИГЛЯД УСТАНОВКИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ

14. ємність для культивування клітин фіксатор гумова кришка КРІПЛЕННЯ ЄМНОСТІ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ СХЕМА ДОСЛІДНОЇ УСТАНОВКИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН ТА БІОСИНТЕЗУ ІНТЕРФЕРОНУ

15. 2 2 1 1 ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН В СУСПЕНЗІЙНІЙ КУЛЬТУРІ ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН В МОНОШАРОВІЙ КУЛЬТУРІ ПТП 1 – стаціонарні умови 2 – культивування в дослідній установці

16. ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН-ПРОДУЦЕНТІВ ІФН З ІММК КІЛЬКІСТЬ СИНТЕЗОВАНОГО ІФН - культивування в дослідній установці; - стаціонарні умови культивування

17. 107 105 106 5×106 5×107 5×105 ЗАЛЕЖНІСТЬ РІВНІВ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ МОНОШАРОВИМИ КУЛЬТУРАМИ ВІД ПОЧАТКОВОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КЛІТИН – ПТП; – L41; – L929.

18. 105 5×105 106 107 5×107 5×106 ЗАЛЕЖНІСТЬ РІВНІВ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ ЛЕЙКОЦИТАМИ ВІД ПОЧАТКОВОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КЛІТИН

19. – суспензійна культура, – моношарова культура (ПТП) ЗАЛЕЖНІСТЬ ВИХОДУ СИНТЕЗОВАНОГО ІФН ВІД СПІВВІДНОШЕННЯ ЧАСТОК ІММК ДО КЛІТИН ЗАЛЕЖНІСТЬ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ КЛІТИН ВІД СПІВВІДНОШЕННЯ ЧАСТОК ІММК ДО КЛІТИН

20. АПАРАТУРНА СХЕМА ОТРИМАННЯ ІНТЕРФЕРОНУ І ТИПУЗВИКОРИСТАННЯМ ІММОБІЛІЗОВАНОЇ ІНДУКТОРНОЇ СИСТЕМИ БАГАТОРАЗОВОЇ ДІЇ 1 - З ЛЕЙКОЦИТІВ 2 - ЗКУЛЬТУР КЛІТИН

21. ВИСНОВКИ • Розроблено технологію одержання препаратів інтерферону І типу з використанням імобілізованого молекулярного комплексу (ІММК) у якості індуктору, яка дає змогу використовувати ІММК впродовж шести циклів інтерфероногенезу. • Сконструйовано штучні конструкції для здійснення процесу індукції ІФН І типу (α/β-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону. Показана інтерфероногенна здатність таких конструкцій, вивчена динаміка синтезу індукованого ними ІФН і доведена його належить до ІФН І типу (α/β-ІФН). • Досліджено значення величин ζ-потенціалів індукторних систем на основі Сферону 300 та лейкоцитів: (-3,9 mV) – Сферон 300-РНК; (-4,6 mV) – Сферон 300-ридостин; (-5,2 mV) – Сферон 300-poli(I)-poli(C);лейкоцити (-13,5 mV) • Встановлено, що вміст іммобілізованих рибополінуклеотидів в отриманих індукторних системах становить (мкг/г): на основі Сферону 300 (РНК – 31,8±2,6, ридостин – 30±2, poli(I)-poli(C) – 28,7±3); на основі Сефадексу G-50 (РНК – 24,6±1,2, ридостин – 22,2±1,6, poli(I)-poli(C) – 21,7±3,9); на основі Сефарози 4В (РНК – 29,3±2, ридостин – 27,1±3, poli(I)-poli(C) – 26,8±3,9). • Визначено кількісні та часові параметри синтезу ІФН клітинами-продуцентами суспензійної та моношарових культур під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування. Встановлено, що найвищого рівня продукція ІФН лейкоцитами крові людини досягає на 10 год, ПТП – через 4 год, L-41 – через 3 год, а L-929 – через 5 год. • Розроблено і сконструйовано дослідну установку, яка може слугувати прототипом промислової апаратури при одержанні ІФН в умовах in vitro індукованого за допомогою ІММК з застосуванням моношарових та суспензійних клітинних культур. • Експериментально оцінено ефективність та проведено підбір технологічних параметрів інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК. Встановлено, що оптимальними параметрами інтерфероногенезу є швидкість обертів валу 5 об/год, вміст сироватки великої рогатої худоби 17 %, співвідношення клітин-продудентів до часточок індуктору 100 до 1. • Розроблено апаратурно-технологічну схему отримання інтерферону І типу для обох типів досліджених культур з використанням іммобілізованої індукторної системи багаторазової дії.

22. Дякуюза увагу!