Michael T. Hemann, Margaret A. Strong, Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider

1. The Shortest Telomere, Not Average Telomere Length, Is Critical for Cell Viabilityand Chromosome Stability Michael T. Hemann, Margaret A. Strong, Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider Presentación: Cinalli, Alejandro Holgado, María Pía Salvatierra, Damiana Scazzina, Brenda

2. Telómeros • Son estructuras especializadas presentes en las terminaciones naturales de los cromosomas, que permiten la estabilidad cromosómica (Repetición TTAGGG) • Mantienen su longitud por un equilibrio acortamiento-elongación.

3. ¿Qué determina la pérdida de función telomérica? En ausencia de telómeros con un largo adecuado se observan fusiones cromosómicas (final con final), arresto del ciclo celular y apoptosis en células germinales (infertilidad).

4. ¿Qué dispara la respuesta celular? Dos hipótesis: • El promedio de la longitud telomérica • El telómero más corto

5. OBJETIVOS Determinar si la respuesta celular se dispara por un promedio de longitud telomérico bajo, o si se debe a la presencia individual de telómeros muy cortos.

6. Modelo animal • mTR = murine telomerase RNA (templado para la síntesis del telómero) Ratones mTR -/- no presentan el RNA que sirve como templado no tienen actividad telomerasa Inicialmente (G1) no presentan fenotipo, en generaciones más tardias (ej: G4) los telómeros son más cortos y hay eventos de fusión

7. mTR-/- (iF1) mTR+/- (iF1) 50% tel largos 50% tel cortos mTR +/- mTR-/- (G6) Telómeros cortos X Los telómeros cortos inician una rta celular en ratones mTR -/-

8. TUNEL - TdT- mediated dUTP nick end labelling Daño al DNA- roturas de cadenas por cortes con endonucleasas Apoptosis TdT transfiere dUTP biotinilado Detección por streptoavidina-HRP Incubación con DAB

9. mTR+/- y mTR-/- G3 no muestran infertilidad y sus niveles de apoptosis de células germinales o fusión de cromosomas son los de un wild-type. mTR-/- G6 es generalmente no fértil

10. mTR-/- (iF1) presentó valores similares a los de un mTR-/- G6. • mTR+/- (iF1) mostró los mismos resultados que un wild-type. • Esto indica que el agregado de la telomerasa “rescató” a este fenotipo. Y que la respuesta celular se debe a la presencia de telomeros cortos.

11. Se comparó la distribución de longitudes de los telómeros de mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1), con mTR+/-, mTR-/- G3 y mTR-/- G6 usando Q-FISH. La longitud del telómero esta representada como unidades teloméricas fluorescentes (TFUs). El resultado se expresó como distribución de frecuencias de TFUs. Elongación preferencial de telómeros cortos en ratones mTR+/- (iF1)

12. Q-FISH • Mide el largo individual de los telómeros • Células arrestadas en metafase teñidas con sonda fluorescente específica de telómeros. • Tinción con DAPI para visualizar cromosomas. • Medición cuantitativa de la señal fluorescente para determinar largo de telómeros.

13. Se ve un cambio significativo en el promedio entre mTR+/- y mTR-/- G3. Pero la diferencia fue mínima entre mTR -/- G3 y los mTR (iF1s). • Entre mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1) se vio una diferencia en el número de telomeros muy cortos. • Esto mostraría que la función telomérica se restaura por la adición de repeticiones a los telómeros mas cortos y no por una elongación global.

14. La restitución de la actividad de telomerasa ocurre temprano en el desarrollo Fibroblastos embrionarios (MEFs) de ratones mTR -/- (iF1) y +/- (iF1) de 13,5 días de gestación.

15. % de terminaciones de telómeros sin repeticiones teloméricas (signal free ends) Análisis citogenético: número de fusiones por metafase

16. Estudio de la sensibilidad a la radiación ionizante - Irradiar con Cs137 radiación beta y gamma - Medir % viabilidad con azul de tripan

17. La telomerasa restituye las repeticiones en los +/- Probablemente la telomerasa sea dirigida específicamente a telómeros cortos y disfuncionales ¿Reclutamiento por proteínas que reconocen telómeros disfuncionales? ¿Reclutamiento por proteínas ausentes?

18. Existe una distribución no azarosa de las fusiones entre cromosomas en una línea de ratones mTR -/- • SKY (Spectral Karyotype- Cariotipo espectral en colores) • Q-FISH (Quantitative fluorescence in situ hybridization)

19. SKY - Análisis de todos los cromosomas de un organismo simultáneamente, cada uno de ellos se encuentra marcado con un color diferente - Se usan sondas de DNA fluorescentes que emiten entre los 200 y 700 nm - La discriminación por el color se consigue por medio del análisis espectral de las señales fluorescentes

20. SKY (Spectrl Karyotype) en esplenocitos de mTR -/- SKY – Fusión de cromosomas 19 por los brazos P Tinción con DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)

21. Cromosoma 19: 12 de 14 Cromosoma 5: 10 de 14 Cromosomas 3, 9, 10 e Y: sin eventos de fusión

22. Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los de telómeros más cortos Metafases de mTR-/- G6 Q-FISH Para determinar qué telómeros no emitían señal SKY Para determinar la identidadde los cromosomas

23. Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los de telómeros más cortos Un cromosoma con extremo libre de señal tiene mayor probabilidad de fusión que un cromosoma conteniendo repeticiones teloméricas Análisis estadístico

24. Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los de telómeros más cortos El telómero más corto es el más propenso a perder función y sufrir fusióncon otro telómero corto Esto sugiere que es necesaria la presencia de dos telómeros cortos para que se dé un evento de fusión en la célula Estudios en células humanas El cromosoma 17 podría estar involucrado más frecuentemente en rearreglos El telómero en 17p es normalmente más corto que los otros La ubicación de p53 en 17p contribuiría a la frecuente pérdida de p53 en los tumores humanos

25. Repeticiones satélite Repeticiones teloméricas Repeticiones satélite No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6 Estudios previos

26. No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6 Clonado por PCR de la zona de la fusión mTR-/- G5-G6 Wild-type Se generaronproductos específicos No se generaron productos específicos Secuenciación La unión consistía en 2 pequeñas secuencias satélite fusionadas directamente

27. No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6 Ninguna unión mostró secuencias de repetición telomérica Todas mostraron secuenciasde microhomología Características de eventos de fusióndados por mecanismos NHEJ (non-homologous end joining)

28. Sonda específica para repeticionessatélite pequeñas de ratón No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6 FISH Todas las fusiones mostraron una señal disminuida en relación a satélites normales

29. Una línea independiente de ratones mTR -/- presenta diferentes telómeros cortos y diferentes fusiones cromosómicas. • Cada línea se establece por eventos al azar durante la fertilización inicial. • La distribución de telómeros cortos vs las fusiones observadas no fue azarosa, ¿ocurre lo mismo en otras líneas?

30. Linea 2 El resultado es una distribución no azarosa de longitudes teloméricas respecto de las fusiones pero los cromosomas cortos involucrados son distintos.

31. Las longitudes teloméricas en ratones wild-type no son cromosoma específicas. • SKY y Q-FISH: distribución de las longitudes teloméricas para cromosomas individuales. • Análisis estadístico: comparación entre la distribución longitudes de cada telómero y las demás distribuciones para el resto de los cromosomas.

32. No hay ningún final cromosómico que tenga una distribución de longitudes teloméricas cortas más reproducible que otros telómeros en ratones wild-type.

33. Conclusión: • No es la longitud promedio de los telómeros la que gatilla la respuesta celular, sino la presencia de telómeros individuales con longitudes muy cortas.

34. La presencia de telomerasa rescata los fenotipos con telómeros disfuncionales.

35. El rol esencial de la telomerasa no sería el mantenimiento del promedio del largo de los telómeros, sino el mantenimiento de la función de los mismos, cuando alcanzan un largo mínimo crítico.

36. No hay telómeros que presenten tendencia a ser más cortos, pero sí los telómeros más cortos originan fusiones cromosómicas (final con final).