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微生物学实验三

微生物学实验三. 免疫与病原生物学教研室. 病原性球菌的分离鉴定程序 （以葡萄球菌为例）. 脓汁标本. 直接涂片镜检 （形态、排列、染色）. 分离培养. 观察分离培养结果. 革兰染色镜检 （形态、排列、染色）. 生化反应 （血浆凝固酶 耐热核酸酶 发酵甘露醇 触酶试验）. 纯培养，做药 敏试验. 肠道杆菌分离鉴定流程. 粪便标本.

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微生物学实验三

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Presentation Transcript

  1. 微生物学实验三 免疫与病原生物学教研室

  2. 病原性球菌的分离鉴定程序 （以葡萄球菌为例） 脓汁标本 直接涂片镜检（形态、排列、染色） 分离培养 观察分离培养结果 革兰染色镜检 （形态、排列、染色） 生化反应（血浆凝固酶 耐热核酸酶 发酵甘露醇 触酶试验） 纯培养，做药 敏试验

  3. 肠道杆菌分离鉴定流程 粪便标本 直接涂片镜检(形态、排列、染色) 分离培养（SS培养基） 观察SS平板分离培养结果 双糖铁培养基 革兰染色镜检 血清学反应 生化反应 确定结果

  4. 实验内容 • 药敏试验结果观察 • 观察双糖铁培养基的培养结果 • 五种糖发酵试验 • 肠道杆菌动力试验（示教） • 血清学鉴定肠道病原菌 • 荚膜染色法

  5. 荚膜染色法 • 解剖小鼠，取脏器（心血，肝，脾，肺，肾）断面涂片，后室温自然干燥。 • 火焰固定涂片 • 在涂片上加一块滤纸，然后加结晶紫染液，并在火焰上略加热至发生蒸气为止，约2分钟（勿干）。 • 倾去染液，除去滤纸片。加20%硫酸铜溶液，约2分钟，倾去染液，用滤纸吸干。 • 镜检，观察荚膜的位置与形态。

  6. 肺炎链球菌荚膜

  7. 药敏试验结果观察 观察药敏结果 测量抑菌环直径 测定细菌对抗生素的敏感度，可供临床治疗 选用药物时参考。

  8. 结果判定 一般抑菌环直径 • 在15mm以上者为高度敏感； • 10～15mm者为中度敏感； • 10mm以下者为低度敏感； • 无抑菌环者为耐药。

  9. 观察双糖铁培养基的培养结果 • 双糖铁琼脂的未接种管为桔红色。 • 细菌生长部位的酸碱变化以酚红为指示剂反映出来，酸性为黄色；碱性为粉红色。 • 所有的肠道杆菌都分解葡萄糖，但对乳糖分解情况不一，据此可初步判断致病菌和非致病菌。 • 如细菌分解糖，则产生酸性物质，细菌分解蛋白胨，则产生碱性物质。细菌生长部位的酸碱性是由细菌对糖和蛋白胨作用的双重因素所决定，其表现类型如下：

  10. 非肠道杆菌 未接种细菌或 非肠道杆菌 肠道杆菌 （疑为非致病性） 肠道杆菌 （疑为致病性） 结果判定

  11. 五糖发酵试验 【原理】 • 糖发酵试验用于检查细菌对加在基础培养基中的糖发酵产酸或产酸产气的能力。 • 细菌发酵产酸与否，通过加在培养基中的酸碱指示剂溴甲酚紫进行判断，如由原来的紫色变为黄色，为糖发酵试验阳性，如颜色不变，为阴性。 • 如在发酵管内有气泡产生，为产气；否则为不产气。

  12. 【目的】 通过检查细菌发酵糖产酸或产酸产气的能 力来鉴定细菌。 【材料】 肠道杆菌鉴定中常用的有：葡萄糖，乳糖， 麦芽糖，甘露醇，蔗糖

  13. 【标本】 　双糖铁斜面培养物 【方法】 　用接种针将细菌接种于培养基内，37℃培养 24小时观察结果。 【结果】 　产酸使培养基由紫变黄，为阳性， 　产气在管内出现气泡； 无变化为阴性。

  14. 葡 乳 麦 甘 蔗 埃希菌属 + + + + +∕- 沙门菌属 + - + + - 志贺菌属 + - - + -

  15. 肠道杆菌动力试验（示教） 【原理】 • 是利用半固体培养基（亦称动力培养基）检查所接种的细菌有无鞭毛的试验。 • 鞭毛是细菌的运动器官，细菌有无鞭毛，除可通过鞭毛染色和镜下悬滴直接观察判定外，也可通过细菌在半固体培养基中的生长现象进行间接判定。

  16. 丛毛菌 单毛菌 双毛菌 周毛菌 鞭毛菌分类

  17. 如细菌在该培养基中主要沿穿刺线生长，周围培养基质保持澄清，为动力试验阴性，表明细菌无鞭毛；如细菌在该培养基中主要沿穿刺线生长，周围培养基质保持澄清，为动力试验阴性，表明细菌无鞭毛； • 如细菌生长离开穿刺线扩散到培养基中，使培养基混浊，呈现绒毛条纹状生长物，为动力试验阳性，表明细菌有鞭毛。

  18. 阴性 阳性

  19. 血清学鉴定肠道病原菌 • 目的：确定粪便标本中致病菌的属种型。 • 原理：利用已知的特异抗体与相应的细菌抗原进行直接凝集反应，依次可以确定菌属、菌种及菌型（即血清型）。 • 材料： 1可疑致病性肠道杆菌在双糖铁培养基中18～24小时培养物 2沙门菌属与志贺菌属诊断血清

  20. 表1 常见沙门菌的抗原成分

  21. 表2 常见志贺菌的抗原成分

  22. 沙门菌属与志贺菌属诊断血清： • 沙门氏菌属多价抗“O”血清：含有A-E组各组的特异性“O”抗原的抗体血清（O2，O4，O6，O9，O3） • 沙门氏菌属组特异性抗“O”因子血清；只含有代表每组特异性的“O”抗原的抗体血清。 • 沙门氏菌属型特异性的抗“H”因子血清：只含有一种“H”抗原的抗体血清。（ a，b，c，d，e，gm） • 志贺氏菌属多价血清：含有福氏，宋氏，鲍氏，志贺氏四群的抗体血清。（A，B，C，D） • 志贺氏菌属群多价血清：含每群中各型的抗体血清。 • 志贺氏菌属型特异性血清：含一种型特异性抗体血清。 (B2a)

  23. 实验方法:直接凝集实验（玻片法） • 沙门氏菌属的鉴定：如初步鉴定为沙门氏菌属，则从斜面上取菌先与沙门氏菌属多价血清作玻片凝集试验，如发生凝集，再进一步用组特异性血清（抗“O”因子血清）定组。如发生凝集，再用型特异性的抗“H”因子血清定型。 • 志贺氏菌属的鉴定：如初步鉴定为志贺氏菌属(痢疾杆菌)，则取菌与志贺氏菌属多价血清作玻片凝集先定属，如发生凝聚，再取群多价血清作玻片凝集，顺序是福氏，宋内氏，痢疾，鲍氏，以便确定属于何群。如发生凝集，再定型。

  24. 玻片凝集反应 阳性

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