Mikroobikultuuride säilitamine ja kultuurikollektsioonid

1. Mikroobikultuuride säilitamine ja kultuurikollektsioonid

2. Miks vajalik?: • Et alles hoida uurimisobjekti (teaduses), • 2. Et alles hoida töövahendit (produtsent, kääritaja jne) mikrobioloogiatööstuses

3. On 2 põhilist moodust: • rakud veetustada (kuivatamine). • 2. rakke hoida madalal temperatuuril (külmutamine).

4. Kultuuride ettevalmistamine hoiule panekuks 1) Enne tuleb kultuuri puhtust kontrollida nii väljakülvidel tardsöötmetele kui ka mikroskoopiliselt. 2) Hoiulepandav kultuur kasvatatakse üles talle optimaalsetes tingimustes kuni statsionaarse faasi alguseni. Sporogeensed tüved lastakse sporulatsiooni. On teada, et sellised kultuurid taluvad paremini stressi.Statsionaarses faasis aktiveeritakse stressivalke kodeerivad geenid. Ka kuumashoki valgud on stressivalgud. Kui tüvedesid kasvatada enne hoiule panekut mõnda aega kõrgemal temperatuuril, siis aktiveeruvad strssivalke kodeerivad geenid ja rakkudesse sünteesitakse valke, mis aitavad paremini ja pikka aega säiluda. 3) Säilitatavast mikroobist valmistatakse tihe suspensioon, 108-109 r/ml. Vöib kasutada suspensiooni steriilset fuugimist ja ülessuspendeerimist väiksemas mahus, aga vöib ka rakud maha pesta tardsöötmelt, kasutades selleks kas steriilset söödet vöi steriilset füsioloogilist lahust.

5. Kultuuride ettevalmistamine hoiule panekuks 3) Säilitatavast mikroobist valmistatakse tihe suspensioon, 108-109 r/ml. Vöib kasutada suspensiooni steriilset fuugimist ja ülessuspendeerimist väiksemas mahus, aga vöib ka rakud maha pesta tardsöötmelt, kasutades selleks kas steriilset söödet vöi steriilset füsioloogilist lahust.

6. Kultuuride ettevalmistamine hoiule panekuks Selleks, et määrata ellujäävuse määra pärast säilitamist, peab tegema väljakülvid tardsöötmetele enne hoiule panekut ja ka siis, kui kultuur peale säilitamist kasutusele vöetakse. Soovitav on teha need väljakülvid rikkale söötmele. Ellujäävust väljendatakse %des. NB! Kunagi ei jää kõik rakud ellu!

7. Bakterite ja pärmide säilitamine Sagedane ühest koloonist ümberkülv ei ole siiski hea, sest see vöib viia mutantideselekteerumisele. Seetöttu soovitatakse külvata ümber mitte ühest kolooniast. Umberkülvatud kultuure hoitakse pimedas, madalal temperatuuril (4-6oC). Meetodi eeliseks on hea visuaalne kontroll kultuuri üle: kas on kuivanud vöi saastunud.

8. Bakterite ja pärmide säilitamine Neid saab säilitada perioodiliste ümberkülvidega värskele söötmele. Erinevad bakterid säilivad ümberkülvamata erineva aja jooksul. Näiteks piimhapebaktereid näiteks on vaja värskesse söötmesse külvata ümber iga 20 päeva järel, kuna nad toodavad piimhapet ja seda ise kõrges kontsentratsioonis ei talu. Vibrio’t, E. coli’t ja Propionibacterium’i soovitatakse über külvata kord kuus. Paljusid baktereid vöib külvata ümber iga 2-3 kuu järel, pärme enamasti 2 x aastas.

9. Bakterite ja pärmide säilitamine Ümberkülvisöötmetena kasutatakse kas kaldagareid, harvem agartulpa (E. coli), tardsöötmeid petri tassil vöi vedelsöödet (piimhapebakterid, tioonbakterid). Umberkülvi sagedus söltub sellest, kas kultuuri hoida öli all vöi mitte. Õli all seisavad kauem, sest kultuurid ei kuiva ja nende ainevahetus on aeglasem.

10. Praktikas kasutatakse bakterite säilitamiseks ümberkülvidega järgmisi söötmeid: LB.Citrobacter, E. coli, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus jne. LB + õllevirre (1:1).Mycobacterium flavum, Mycobacterium lacticola, Bacillus. Kartuliagar.Bacillus

11. Praktikas kasutatakse bakterite säilitamiseks ümberkülvidega järgmisi söötmeid: Piim.Laktobatsillid Õllevirre + 6% etanool.Acetobacter YPD .Pärmid Chapeki agar.Streptomyces

12. Kultuuride hoidmine mineraalõli kihi all On suhteliselt hölbus meetod. Vöimaldab agarsöötmetele vöi vedesöötmetele külvatud kultuure hoida ümber külvamata 3-4 aastat. Tavaliselt kasutatakse küll tardsöödet, kaldagarit. Kultuur kasvatatakse ette sobival söötmel väikese kaldpinnaga kaldagaril. Fakult. anaeroobid kasvatatakse poolvedelas söötmes ja anaeroobid pistekülvina agartulbas. Peale valatakse steriilne vaseliinõli. Seda steriilitakse 1 tund 1 atü juures autoklaavis, seejärel kuumutatakse niiskuse eraldamiseks kuivatuskapis 15oC juures vöi hoitakse toatemperatuuril 2-3 päeva.

13. Kultuuride hoidmine mineraalõli kihi all Õli valatakse üleskasvanud kultuurile peale nii palju, et see ulatuks ca 1 cm üle kaldagari ülemise ääre. Kui ölikiht on liiga paks, siis rakud ei saa hapnikku, kui liiga öhuke, siis kultuur vöib kuivada. Kultuuri hoitakse 5oC juures vöi ka toatemperatuuril pimedas. Külvatakse välja õlikihi alt steriilse aasaga. Peab hoolitsema, et õlipritsmed, kus on elusaid mikroobe, ei nakataks personali. Seda peab silmas pidama patogeenide puhul.

14. Kultuuride hoidmine filterpaberil On mugav moodus kultuuride saatmiseks kirjaga. Steriilsed filterpaberikettad immutatakse mikroobi vedelkultuuriga vöi agarilt mahapestud suspensiooniga, kuivatatakse kas öhu käes vöi vaakumis ja pakitakse steriilsesse fooliumi. Hoitakse külmas ja pimedas.

15. Selliste kultuuride kasutamine 1) Steriilsetes tingimustes pannakse kettake steriilsesse kasvusöötmesse ja inkubeeritakse mikroobile sobival temperatuuril, kuni ilmneb kasv. 2) Tehakse väljakülv vedelsöötmest tardsöötmele ja uuritakse kultuuri puhtust ja omadusi. Edasi võib hoida ümberkülvidena või teha stokid sügavkülmas säilitamiseks.

16. Selliste kultuuride kasutamine Filterpaberil saadetakse välja ka transformeeritud bakteritüvesid, mis kannavad mingeid plasmiide (raamatukogu kloonid jne). Saadud kultuurid kasvatatakse üles nii, et plasmiid ei elimineeruks rakust (AB selektsioon!) ja eraldatakse rakkudest plasmiidne DNA.

17. Kuivatamine Kuivatamisel kaotavad rakud vaba vee. Kuivatamisel säiluvad hästi spoorid, nii seente kui ka aktinomütseetide spoorid, 2-5 aastat vöi kauemgi. Kultuur kuivatatakse õhu käes. Võib kasutada ka adsorbente: steriilset mulda, liiva, silikageeli, filterpaberit jm.

18. Kuivatamine Bakterite ja aktinomütseetide spoore hoitakse sageli steriilses mullas vöi loomulikult ära kuivanud söötmetes. Muld steriilitakse autoklaavis 2 tundi kahel korral. 1 ml spoorisuspensiooni viiakse katseklaasi steriilse mullaga ja hoitakse toatemperatuuril, kuni on näha, et muld on kuiv. Katseklaas suletakse steriilse korgiga ja hoitakse 4-6oC juures.

19. Säilitamine steriilses dest vees või füsioloogilises lahuses Väga sobiv meetod väikestele laboritele. Rakud pestakse kaldagari pinnalt dest veega vöi füsiol. lahusega. Tihedad suspensioonid valatakse steriilsetesse viaalidega, suletakse ja hoitakse 4-6oC juures. Dest vees säiluvad 1 aasta jooksul P. fluorescens, P. aeruginosa, E. coli, S. aureus. Sporogeensed bakterid säiluvad 2-5 aastat. Arvatakse, et nad säiluvad seal surnud rakkude ja varuainete arvel.

20. Säilitamine madalatel ja ülimadalatel temperatuuridel Külmutamine on väga levinud meetod mikroobide säilitamiseks. -20oC juures saab enamikku baktereid hoida 2-4 aastat. -70oC juures säiluvad nii bakterid kui ka pärmid hästi. -150oC juures hoitakse kultuure vedela lämmastiku aurudes ja -196 oC juures vedelas lämmastikus.

21. Säilitamine madalatel ja ülimadalatel temperatuuridel Kui rakud külmuvad, siis tekivad rakkudes jääkristallid, mis löhuvad rakku. Et seda ei juhtuks, tuleb külmutatavatele kultuuridele lisada krüoprotektoreid: glütserooli, DMSO (dimetüülsulfoksiid), seerumit, sahharoosi, laktoosi, sorbitooli jms. Glütserool ja DMSO difundeeruvad hölpsast rakku ja alandavad rakuplasma külmumistemperatuuri. Teised ained rakku ei tungi ja nad stabiliseerivad rakku ilmselt väljastpoolt.

22. Säilitamine madalatel ja ülimadalatel temperatuuridel Glütserool steriilitakse autoklaavis, 10% DMSO lahus filtreerimisega. Säilitatavas kultuuris peaks DMSO kontsentratsioon olema 5%, glütserooli oma 15-40%.

23. Glütseroolistokkide tegemine pärmidel: mida läheb vaja? • Steriilne 15% glütserool (autoklaavitud). • Steriilsed eppendorfid. • Steriilsed külviaasad või hambatikud. • Steriilsed pipetiotsikud.

24. Glütseroolistokkide tegemine pärmidel • Kasvata rakud üles vedelsöötmes stats. faasi algusesse. • Tsentrifuugi steriilses eppendorfis põhja ca 3-5 ml suspensiooni. • Suspendeeri rakud üles 300-500 l 15% steriilses glütseroolis. • Tähista eppendorf ja pane külma (-60 oC)

25. Glütseroolistokkide kasutamine • Võta stokk külmast ja sulata ainult nii palju üles, et pinnalt veidi sulab. • Külva steriilse tikuga veidi materjali sobivale tardsöötmele. • Pane stokk kohe külma tagasi. • Kui kolooniad on tassil üles kasvanud, kontrolli neid ja kasuta.

26. Glütseroolistokkide tegemine pärmidel Võid glütserooli stokkidena säilitada mitte ainult tavalisi tüvesid, vaid ka transformante. Kuna mõned pärmid on raskesti transformeeritavad, siis on otstarbekas ka saadud transformante hoida.

27. Lüofiliseerimine See on külmutatud rakkude kuivatamine vaakumis. Kultuurid säiluvad nii eluvöimelisena v. pikka aega, kuni 20 aastat. Suurte kollektsioonide puhul on see väga hea meetod. Lüofiliseerimisele minevaid kultuure kasvatatakse optimaalsetes tingimustes stats faasi alguseni ja sporogeensed lastakse sporulatsiooni. Kultuuri tihedus olgu suur: 108-1010 r/ml. Seejärel suspendeeritakse rakud kaitsesöötmetes e. krüoprotektorites.

28. Lüofiliseerimine Näiteid kaitsesöötmetest: 1. zhelatiin, 1g sahharoos, 10g, dest vesi, 100 ml. 2. rasvavaba kooritud piim, 100 ml glükoos, 7 g.

29. Lüofiliseerimine Suspensioonid kaitsesöötmetes valatakse 1 ml kaupa ampullidesse ja külmutatakse -20...-70oCni, siis kuivatatakse vaakumis ja joodetakse vaakumis kinni. Lüofiliseeritud rakkude jääkniiskus on 1-6%. Ampulle lüofiliseeritud rakkudega soovitatakse hoida 4oC juures pimedas, aga on hoitud ka toatemperatuuril.

30. Lüofiliseerimine Lüofiliseerimist taluvad v. hästi graampos. bakterid, halvemini graamneg. bakterid ja anaeroobid. Spoorid taluvad seda v. hästi. Lüofiliseeritud bakteritüvedel on täheldatud plasmiidide kadu rakust ja lüsogeensete faagide aktiveerumist, mis toob kaasa raku lüüsi. Plasmiid kinnitub membraanile ja membraanikahjustus lüofiliseerimisel vöib plasmiidi lahti rebida. Seetöttu peab kultuuride omadusi pärast lüofiliseerimist kontrollima.

31. Lüofiliseeritud kultuuride aktiveerimine • Ampull steriilitakse väljast 70o etanooliga. • Ampull asetatakse jäävanni. • Pipetiga pannakse ampulli steriilset puljongit, dest vett vöi kraanivett ja lastakse märguda (10-20 min) ja • külvatakse välja rikkale söötmele.

32. Spray-drying on tehnoloogia, kus kaitsesöötmes suspendeeritud mikroobid pihustatakse kuuma õhu joas ja nad sadenevad kuiva pulbrina. Sama tehnoloogiaga tehakse piimapulbrit jne. See tehnoloogia on palju odavam, kui lüofiliseerimine, kuid elusrakkude hulk on produktis väiksem, kui lüofiliseerimise puhul. Saab ilmselt täiustada. Praegu tehakse selle kallal palju tööd. Uuritakse näiteks, kuidas probiootiliste bakterite preparaate nii säilitada.

33. Mikroobikollektsioonid

34. Alguses säilitasid mikrobioloogid oma isoleeritud tüvesid oma kollektsioonides. 1880-ndatel aastatel alustas Frantishek Kral Prahast keskse mikroobikollektsiooni loomist ja hakkas ka kultuure raha eest välja saatma. 1911. a. Kral suri ja tema kollektsiooni omandas prof Ernst Pribam ning viis selle üle Viini ülikooli. Osa nendest tüvedest on praegu ATCC koosseisus.

35. Vanuselt järgmine on Hollandi kollektsioon Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), mis loodi 1906. a. botaanikute poolt. See kuulub praegu Hollandi Teaduste Akadeemiale. Praegu on üks suurem kollektsioon ATCC (American Type Culture Collection). Venemaal on BKM. Jaapanis on IFO (Institute for Fermentation). Shotimaal NCIB (National Collection of Industrial Bacteria). Inglismaal NCTC (National Collection of Type Cultures).

36. Kui tellida kultuurikollektsioonidest tüvesid, siis peab täitma lepingu, milles kinnitatakse, et tüvesid kasutatakse ainult teaduslikuks otstarbeks ja ei kasutata neid muul eesmärgil. Vastav leping on olemas näiteks ATCC kodulehel internetis http://www.atcc.org/Order/mta1.cfm