Polimeráz láncreakció

1. Polimeráz láncreakció Készítette: Feigl Viktória

2. PCR (polymerase chain reaction) • A speciális, kiválasztott DNS szekvencia amplifikációja enzimes reakciók ismétlődésével in vitro körülmények között. • Szelektív módszer, előnye a hagyományos technikákkal szemben, hogy speciális DNS fragment vizsgálatát teszi lehetővé. • Minden egyes PCR ciklusban a DNS mennyisége a reakcióelegyben megduplázódik, azaz 30 ciklus után 109-szerese a kezdeti DNS mennyiségnek. • A reakció végterméke gélelektroforézissel vizsgálható.

3. Kary B.Mullis (Cetus) fedezte fel 1983-ban 1985-ben jelent meg a cikk 1993-ban kémiai Nobel-díj Ötlet: olyan eljárást kellene kifejleszteni, amely a DNS-t mesterségesen megsokszorozza a DNS-polimeráz enzim segítségével, megismételt duplikációs ciklusok által. PCR története

4. A DNS polimeráz enzim: • Megtalálható az élő szervezetekben • Funkciója a DNS lemásolása a sejt osztódásakor • A DNS egyik szálához kötődve létrehozza a komplementer szálat. Az eredeti eljárás: A kettős szálú DNS két szálra választása 96°C-ra történő hevítéssel

5. 96°C-on a DNS polimeráz lebomlott enzimet minden ciklusban pótolni kellett Kevéssé hatékony Időigényes Nagy DNS-polimeráz fogyasztás Folyamatos figyelem Megoldás:Thermus aquaticus Yellowstone Parkban izolálták (1969) Thomas Brock és Hudson Brock fedezte fel

6. Magas hőmérsékleten stabilis DNS-polimeráz – nem bomlik le a hevítési lépésben, nem szükséges minden ciklusban újat hozzáadni • Eljárás leegyszerűsödése • Automatizálhatóság

7. Taq polimeráz 1976-ban izolálták a T. aquatcus-ból Hőmésékleti optimuma 80°C Hátránya: hibázik, mutációk Nem rendelkezik 3’→5’ hibajavító exonukleáz aktivitással Helyette: Archea Pfu, Pwo, de lassabbak Megoldás: Taq és Pfu kombinációja (gyors és pontos)

8. DNS-templát vagy cDNS– ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját Két primer – amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet Mire van szükség a PCR reakcióhoz?

9. A primerek • Segítségükkel határozható meg az amplifikálandó DNS szakasz • Komplementerek az amplifikálandó DNS szakasz elejével és végével • Rövid, mesterséges DNS szálak • Hosszuk: 17-30 bp • Nem tartalmaznak komplementer régiót (egymással nem képeznek primer-dimert)

10. Primertervezés • Optimális olvadási hőmérséklet: 60-75 °C • Olvadási hőmérséklet: Ahol a primer kötőhelyeinek fele foglalt • Nő a primer hosszával • Túl magas (80°C felett): DNS polimeráz kevéssé aktív – limitált hossz • Legtöbb primer G+C tartalma >50% → magasabb olvadáspont • Két primer egyező olvadási T → nem specifikus termékek elkerülése és mindkét primer felől azonos amplifikáció • Rövid primerek: több helyre kapcsolódhatnának →nem specifikus kópiák • Optimális hossz: 20-40 nukleotid • Specifikus gén vagy egy adott mikroorganizmus faj detektálásához – A keresett DNS-re specifikus primer, amely kizárólag a target szekvenciához kapcsolódik • Mikroorganizmus csoport detektálásához – DNS konzervált régiójára tervezni

11. Degenerált primerek • Hasonló, de nem azonos primerek keverékei • Ha ugyanazt a gént különböző organizmusokból kell amplifikálni (hasonló, de nem azonos gének) • Ha a tervezésnél a fehérjeszekvenciát veszik figyelembe (egy aminosav több kódon) • Csökkentik a PCR amplifikálás specifitását • Problémát részben megoldja a Touchdown PCR

12. PCR eljárás 1. Denaturáció (94-96°C, 1-2 perc) • A két DNS szálat összekötő H-hidak felbomlanak (1. ciklus előtt hosszabb denaturálás a teljes szeparációhoz) 2. Primertapadás / annealing (55-60°C, 1-2 perc) • A primerek hozzákapcsolódnak a DNS szálakhoz • Hőm. ált. 5°C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt 3. Lánchosszabbítás (72°C, 1-2 perc) • A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat • T és t függ a DNS-polimeráztól, t az amplifikálandó szakasz hosszától (ált. 1000 bp/perc) • Utolsó ciklus után hosszabb lánchosszabbítás

13. A PCR-ciklus sematikus ábrája. • Denaturálás • Primertapadás • Meghosszabbítás (P=polimeráz). • Az első ciklus véget ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.

14. Detektálás - Gélelektroforézis A PCR-termék összehasonlítva a DNS-létrával agargélen. A DNS-létra (1. sáv), a PCR-termék alacsony koncentrációban (2. sáv) és magas koncentrációban (3. sáv) Helmut W. Klein, Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

15. Nested PCR Nem specifikus primerkötések, azaz nem kívánt termékek (szennyeződés) kiküszöbölésére. Két sorozat primer két egymást követő PCR reakcióban. A második primerpár (nested primer) az első reakció termékén belül köt („fészkel”). Elv: Ha az első primer rossz helyre köt, nagyon kicsi az esélye, hogy a másodiknak is legyen nem kívánt kötőhelye, azaz ezután is legyen nem kívánt termék.

16. Touchdown PCR • A specifitás növelésére • Elv: a primertapadás hőmérséklete meghatározza annak specifitását – alacsonyabb hőmérsékleten a primer kevésbé specifikusan köt • A kezdeti hőmérséklet a primerek olvadási jóval hőmérséklete (Tm) fölött van • A hőmérsékletet ciklusonként 1-2 °C-kal csökkentik; a primer a lehető legmagasabb, még elviselhető hőmérsékleten fog tapadni, itt a legnagyobb a specifitás • Később ezek a fragmensek amplifikálódnak tovább, elnyomva a nem specifikus termékeket • A hőmérséklet fokozatosan csökken a primer Tm-hez (touchdown hőmérséklet, ideális), utána itt folytatódik a primertapadás további 10 vagy több cikluson át

17. Inverz PCR Ha a target szakaszon belül ismert egy szekvencia – a két szélén nem Emésztés (kis szakaszokra)→ önligálás (cirkuláris forma) → hasítás restrikckiós enzimmel az ismert szekvencián belül → ismert két szélső szekvencia → PCR Szélen elhelyezkedő transzpozonok és genomikus inzerciók identifikálására

18. Reverz Transzkripció PCR (RT-PCR) RNS amplifikációjára • Alkalmazások: • Kis mennyiségben jelen lévő RNS-ek detektálása • cDNS könyvtárak létrehozása Reverz transzkripció „primerje”: oligo dT, ami az RNS 3’ végének poliA szekvenciájához köt (helyette lehet random hexamer vagy specifikus primerek) RT: 37 °C, 1 óra; RNS lebontása RNázH-val; cDNS komplementer szálának szintetizálása magasabb T-n

19. Video Real-Time PCR Kvantitatív módszer! Minden PCR ciklus után megadja a DNS mennyiségét „real-time” * Fluoreszcens festék – a kettős szálú DNS-hez köt * DNS oligonukleotid próba – a kiegészítő szálhoz kötve fluoreszkál Gyakran a Reverz Transzkripció PCR-ral együtt használják kis mennyiségű RNS (mRNS) mennyiségének meghatározására – a gén expresszió szintjének mérése Hagyományos módszer: Northern blotting, hátránya, hogy csak nagy mennyiségű RNS esetén működik

20. Fluoreszcens festék SYBR Green - Kétszálú DNS-hez köt (egyszálúhoz és primerhez nem) miután a DNS-polimeráz megszintetizálta a 2. szálat, fluoreszkál → detektorral mérhető • Standard hígítási sorhoz hasonlítva mérhető a mennyiség • Relatív mennyiséget ad meg • Hátrány: Nem sepcifikus PCR termékekhez is köt, Előny: Relatíve olcsó • Cianid festék • Kék fénnyel indukálható (λmax = 488 nm) zöld fényt bocsát ki (λmax = 522 nm) • Mutagén etídium-bromid helyett használható • Egyéb festékek: SYBR Gold, YO (Oxazole Yellow), TO (Thiazole Orange), PG (PicoGreen)

21. Fluoreszcens oligonukleotid próba – FRET módszer Fluorescence (or Förster) Resonance Energy Transfer Két fluorofór: • Zöld (rövid λ): reporter dye („jelző”), 5’ végen, (gyakran GFP) • Piros (hosszú λ) : quenching dye („elnyomó”), 3’ végen • Az piros fluorofór elnyeli a zöld által kibocsátott fényt FRET által • A próba hozzáköt a DNS-hez, majd a polimeráz működése közben eltávolítja. Így a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól és a kibocsátott fény mérhető. • Előnye: specifikus! • Egyszerre több szekvencia is detektálható többféle színű festék használatával.

22. TaqMan Molecular Beacon Különbség: A molecular beacon intakt marad, minden ciklusban újra tud kötni. Denaturáció során a hajtű szerkezet felbomlik, köt a DNS-hez és fényt emittál, mivel a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól. (Ami nem köt az visszanyeri a hajtű szerkezetet és inaktív.)

23. Mennyiségi meghatározás Minél nagyobb a kezdeti target DNS mennyisége, annál hamarabb észlelhető szignifikáns növekedés a fénykibocsátásban. A fix küszöbértéket egy adott ciklusban éri el a fluoreszcencia (CT = cycle treshold), amit logaritmikus diagramon ábrázolva standard hígítási sorhoz viszonyítva meghatározható a kezdeti DNS mennyisége (relatív – minták egymáshoz hasonlítása) Felhasználás: A gén transzkripció érzékeny mennyiségi meghatározására. Diagnosztika: fertőző betegségek, rák, genetikai rendellenességekben szerepet játszó gének gyors detektálására. Génexpresszió változásának nyomon követése: Szövet vagy sejtkultúrák reakciója gyógyszerekre, környezeti körülmények változására – indukált mutációk (környezeti mikrobiológia – rezisztens gének detektálása).

24. A PCR alkalmazásai • Genetikai ujjlenyomat - személyek azonosítása • Örökletes betegségek kimutatása • Fertőző betegségek kimutatása – fertőzést okozó mikroorganizmus DNS-ének amplifikálása (immunválasz elmaradása vagy álpozitív eredmény esetén is) • Ősi DNS elemzése pl. mamut, egyiptomi múmiák • Rokonság vizsgálat pl. apasági perek, evolúciókutatás • Génklónozás