INTRODUÇÃO

1. Expressão do gene de nodulação nodD2 de Rhizobium tropici estirpe CIAT 899Tsob estresse osmótico e indução por flavonóide. Amanda A P Rolla-Santos1; Douglas F. Gomes1,2; Manuel Megías3, Francisco Javier Ollero3; Mariangela Hungria1. 1Embrapa Soja, Londrina, Brasil, 2Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil,3Universidade de Sevilha, Espanha. INTRODUÇÃO B A * * Bactérias conhecidas coletivamente como rizóbios estabelecem simbioses com leguminosas, formando estruturas específicas, os nódulos, onde ocorre o processo de fixação biológica do nitrogênio, de grande importância para a agricultura e para o meio ambiente. O processo de nodulação é regulado por genes denominados nod, noe e nol, que em uma etapa inicial, quando induzidos por flavonóides, sintetizam moléculas de oligossacarídeos lipoquitínicos, conhecidas como fatores Nod ou LCOs. A síntese dos fatores Nod está sob controle do gene regulatório nodD. No genoma de Rhizobium tropici CIAT899, microssimbionte do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), foram identificados cinco genes nodD. Um desses genes, nodD2, foi descrito como repressor da nodulação em outras estirpes de rizóbios, mas ainda não há informações sobre o seu papel em R. tropici. O objetivo deste estudo foi realizar a mutagênese dirigida do gene nodD2 e identificar os genes envolvidos na regulação e biossíntese dos fatores de nodulação, na presença de flavonóide e sob estresses osmótico. * * * * * * * * Figura 1: Quantificação relativa da expressão dos genes nodD1, nodC e nodD2 via RT-qPCR. Nível de expressão relativa (eixo y) nos diferentes tratamentos NaCl 300mM (A) e Apigenina 1µg/mL (B), no mutante nodD2- (barras pretas) e CIAT899 estirpe silvestre (barras cinza). As análises estatísticas foram realizadas pelo programa REST 2009, onde p≤0,05 *. A B C MATERIAL E MÉTODOS Metagênese dirigida do gene nodD2 Para a obtenção do mutante foi realizada a amplificação via PCR do gene nodD2 com primers específicos. O produto amplificado foi visualizado em gel de agarose 0,8%, sendo posteriormente purificado com Kit QIAquick Gel Extraction Kit Protocol (Qiagen). Depois de amplificado por PCR e purificado, o gene foi clonado no plasmídio pK18mob (Schäfer et al., 1994), vetor que possui resistência à canamicina (KmS). A região codificante do gene de interesse foi interrompida com o interposonΩ (SpcR) (resistente à espectinomicina) proveniente do plasmídio pJBD-2. Os diferentes plasmídios gerados com os genes interrompidos foram transferidos por conjugação à estirpe CIAT899 RifR e selecionaram-se os transconjugantesRifR, SpcRKmS. Os resultados das mutações foram confirmados mediante PCR. RNA e PCR em tempo real A estirpe silvestre (CIAT 899) e a mutadanodD2- foram pré-cultivadas. Após 48 horas os pré-inóculos foram transferidos para novos cultivos. Tanto a estirpe silvestre quanto a mutante nodD2- foram submetidas a três tratamentos; Controle, NaCl 300 mM e apigenina 1 µg/mL. Todos os cultivos foram realizados em triplicata a 28°C sob agitação de 100 rpm, até atingirem a fase exponencial de crescimento (D.O.600: 0.5-0.6). O RNA das culturas foi extraído e, para as análises de PCR em tempo real, foram amplificados os genes nodD1 e nodCcomo alvos e o gene 16rRNA foi utilizado normalizador. A análise da expressão relativa dos genes alvo foi realizada com o auxílio do programa REST 2009 v.2. Teste de nodulação A estirpe silvestre (CIAT 899) e o mutante nodD2- foram pré-cultivadas. Após 48 horas de cultivo os pré-inóculos foram transferidos para novos cultivos. Esses cultivos foram utilizados para a inoculação das sementes de feijão (Phaseolusvulgaris). O teste de nodulação foi realizado em triplicata para os dois tratamentos, CIAT 899 e mutante nodD2- , e conduzido por 20 dias em sacos plásticos incubados em casa de vegetação. Um tratamento sem inoculação também foi realizado como controle negativo da nodulação. NodD2 NodD2 NodD2 TY Controle - CIAT899 Controle + Figura 2: Teste nodulação conduzido em casa de vegetação em plântulas de feijão (Phaseolus vulgaris). A- Controle positivo CIAT899 silvestre; B-Controle negativo, sem incoculação e C- Inoculada com mutante nodD2- . O gene nodD1 não apresentou expressão significativa no mutante nodD2- na presença de NaCl 300 mM (Fig. 1 A). Na CIAT 899 silvestre ocorreu um aumento significativo da expressão no tratamento com apigenina (Fig. 1 B). Em Estevez et al. (2009), mesmo com a mutação do gene nodD1,R. tropici continuou a produzir fatores Nod sob estresse salino, tanto na presença e na ausência de apigenina, indicando que a expressão dos genes nod em R. tropici sob condições ambientais adversas não segue a via clássica de ativação por flavonóides e mediada pela proteína reguladora NodD1. Observou-se que houve expressão significativa na estirpe selvagem nos diferentes tratamentos, indicando que o gene nodD2 está sendo induzido (Fig 1 A e B). No presente estudo foi observado que no tratamento com NaCl 300 mM a mutação do gene nodD2 alterou negativamente a expressão dos gene nodD1 e no gene nodC quando comparado à estirpe silvestre CIAT 899. Esse perfil também foi observado no tratamento com apigenina 1 µg/mL no gene nodC, já no nodD1 foi observado um aumento significativo na expressão no mutante. Esse resultados indicam que o gene nodD2 desempenha um papel importante na regulação de genes nod. Estudos no perfil dos fatores de nod associados ao gene nodD2 devem ser realizados para uma maior entendimento no seu papel dentro da regulação. RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERÊNCIAS Em Rhizobium tropici, a diversidade e a quantidade de fatores de nodulação (Nod) produzidos são diretamente influenciada pelas condições de crescimento bacteriano. Estévez et al. (2009) identificaram 46 fatores Nod estruturalmente diferentes, produzidos por R. tropici CIAT899 sob estresse salino (NaCl 300 mM) e apigenina. Quando induzida apenas por apigenina, foram identificados cerca de 29 fatores Nod, dos quais 15 foram comuns aos sintetizados na presença de NaCl. No presente estudo, foi realizada a mutação do gene nodD2 em R. tropici CIAT 899. Em diversas estirpes de rizóbios, esse gene é descrito como repressor da expressão de genes nod (Fellay et al., 1998; Machado & Krishnan, 2003). Dentre os genes analisados, foi observado que no mutante nodD2-, na presença de NaCl 300 mM (Fig. A), o gene nodC apresentou uma redução de 2,6 vezes na expressão quando comparada à CIAT 899 silvestre. Na presença do flavonóide apigenina a 1 ug/mL, observou-se que o mutante nodD2- apresentou o mesmo perfil de redução na expressão, que foi de 3 vezes (Fig. 1 B). O gene nodC é responsável pelo controle da etapa de elongação da cadeia oligossacarídica dos fatores Nod que são essenciais no processo de nodulação (Kosslak et al., 1987; Brencic et al., 2005). Ensaios em casa de vegetação demonstraram que plântulas de feijão inoculadas com o mutante nodD2- não apresentaram nódulos (Fig. 2). A mutação inibiu o processo de nodulação, o que pode estar relacionado com a redução da expressão do gene nodC na bactéria mutante. Brencic, A.; Winans, S.C.; Colonization, P.; Detection of and response to signals involved in host-microbe interactions by plant-associated bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 69:155–194, 2005. Kosslak, R.M.; Bookland, R.; Barkei, J.; Paaren, H.E.; Appelbaum, E.R. Induction of Bradyrhizobiumjaponicum common nod genes by isoflavones isolated from Glycine max. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:7428–7432. Estevez, J.; Soria-Diaz, M.E.; De Cordoba, F.F.; Moron, B.; Manyani, H.; Gil, A.; Thomasates, J.; Van Brussel, A.A.N; Dardanelli, M.S.; Sousa, C.; Megias, M. Different and new Nod factors produced by Rhizobium tropici CIAT899 following Na+ stress. FEMS Microbiol Lett 293: 220-231, 2009. Fellay, R.; Hanin, M., Montorzi, G.; Frey, J.; Freiberg, C.; Golinowski, W.; Staehelin, C.; Broughton, W.J. & Jabbouri, S. nodD2 of Rhizobium sp. NGR234 is involved in the repression of the nodABC operon. Mol. Microbiol. 27: 1039-1050, 1998. Machado, D. & Krishnan, H.B. nodD alleles of Sinorhizobium fredii USDA 191 differentially influence soybean nodulation nodC expression, and production of exopolysaccharides. Curr. Microbiol. 47: 134-137, 2003. AGRADECIMENTOS Projeto CNPq (400205/2012-5 ) e bolsa pós-doutorado do CNPq.