Q-P.C.R.

1. P.C.R. Q-P.C.R.

2. PCR • La PCR è una metodica sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere grosse quantità di materiale genetico a partire da piccole quantità • La PCR insieme alla possibilità di sintetizzare comodamente qualsiasi tipo di oligo permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero bersagli molto rari in un genoma complesso: 100mila geni. Un gene tra esoni ed introni puo’ arrivare anche a 2x106 bp ca • Una zona specifica di DNA viene bersagliata con due oligo (3’ rivolti l’uno verso l’altro) che amplificano, tramite la reazione polimerasica, la zona stessa copiandola in un enorme numero di volte e rendondola visibile e manipolabile per l’analisi. • Si usa una Taq polimerasi • Si usa un eccesso di oligo per favorire l’amplificazione fra gli oligo piuttosto che tra il DNA di partenza e il suo oligo • Si raggiugne la saturazione della reazione quando ci sarà riassociazione solo fra i prodotti amplificati invece che con gli oligo

3. ..animazione

4. TM = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(G+C)-(600) N N 5’ GTCCTACACCTACGAGTGG 3’ 3’ GGTGAGCATCCACATCCTG 5’ 5’ GTCCTACACCTA 3’ GGTGAGC Progettazione dell’oligo • la % di G e C e la lunghezza dell’oligo influenzano le T. di annealing • Evitare la formazione di strutture secondarie: • Inter-filamento (dimeri di primer) Intra-filamento (Hairpin loops)

5. Q-PCR • La PCR tradizionale ci permette di ottenere informazioni genetiche amplificando il DNA partendo da quantita’ molto basse di copie target • La quantità di prodotto finale non e’ in correlazione con il numero di copie terget del DNA specifico di partenza • Molte applicazioni in medicina o in ricerca richiedono la quantificazione del numero di copie target del campione di partenza per es: • determinazione della carica virale nel sangue per la diagnosi di infezioni di HIV o HCV • l’analisi dell’espressione genica da i livelli di mRNA

6. PERCHE’ QUANTIFICARE? • DNA: • alterazioni quantitative, DNA mitocondriale Nel corredo mutato le quantia’ dei geni variano • genomi estranei (microorganismi, OGM) • DNA fetale (nel sangue materno aumenta nei casi di sofferenza del feto) • DNA tumorale (aumenta nei soggetti affetti da neoplasie) • mRNA: • trascritti virali • variazioni temporali • variazioni individuali • variazioni patologiche • trascritti anomali (fusione, splicing) • Durante la vita cellulare, sopravvivenza, crescita e differenzazione si riflettono in variazioni di espressione genica. Quantizzare i livelli di espressione genica è un punto determinante nella comprenzione della funzione di un gene • La quantificazione di un gene in linee cellulari sottoposte a trattamento farmacologico ci permette di studiarne la sua modulazione La regolazione dell’espressione genica varia in funzione del soggetto, patologia, sesso ecc.

7. Metodi per la misura dei prodotti nella PCR tradizionale • PCR radiottiva • Ibridazione • Primers, sonde, Elisa • HPLC • ETbr e densitometria • Sonde fluorogeniche Conventional PCR Real-Time PCR amplification curve Plateau phase Ethidium-Gel detection Log-linear phase NTC baseline region NESSUNO di questi sistemi garantisce la reale quantificazione del prodotto di PCR. Ognuno ha variabili che influenzano e modificano il risultato La linearita’ della reazione esponenziale della PCR è limitata solo a pochi cicli. L’amplificazione nella fase esponenziale non è rilevabile con i sistemi tradizionali. Per es. con ETbr io rilevo solo il prodotto nella fase di platau. Le fasi esponenziali sono diverse per amplificati diversi

8. Variabili che influenzano la resa della PCR: • Estrazione del DNA o RNA • Scelta del primer (Tm, strutture del target,omologie interne,contenuto GC/AT) • Condizioni di amplificazione (Ta, estenzione, Mg, Taq, ramping, strumento) • Variabili imprevedibili (variazioni di T, formazione di aspecifici nei primi cicli) • Se facciamo 96 amplificati su piastra i prodotti finali risulteranno tutti diversi • Se invece misuro il punto d’inizio dell’amplificazione esponenziale allora il coefficente di variazione sara’ molto basso e i prodotti saranno molto simili REAL-TIME PCR(o PCR Quantitativa): Tecnica che permette la quantificazione e l’ identificazione in tempo reale dei prodotti di amplificazione. La rilevazione dei prodotti di PCR direttamente nella provetta è resa possibile dall’uso di “probe” oligonucleotidici marcati con sostanze fluorescenti

9. PCR Convenzionale vs. PCR Real-Time Problemi con l‘analisi “end-point“ nella PCR tradizionale Con il progredire della reazione, alcuni reagenti vengono consumati come risultato dell‘amplificazione. Questa deplezione avverrà con velocità differente per ciascuna replica Divergenza !!! rilevazione tradizionale Rilevazione Real-Time PCR

10. Principio base della Real-Time PCR Si determina QUANDO viene generato il segnale piuttosto che l‘intensità del segnale stesso (analisi all‘end –point) Sample Ct = threshold cycle: Il numero di cicli al quale il prodotto di PCR supera la soglia di rilevabilità Ct threshold non-template control baseline region

11. log-phase analysis end-point analysis N • Alta concentrazione • Bassa concentrazione • N: numero delle molecole amplificate • n: numero dei cicli di amplificazione n Threshold unknown sample La quantificatione nella PCR Real-Time • La quantità iniziale di DNA è inversamente proporzionale al numero di cicli necessario per la rivelazione (Ciclo soglia, Ct) • Amplificando quantità note dello stesso templato, le quantità ignote si ricavano per interpolazione dalla curva standard.

12. Metodi di marcatura e rivelazione fluorescente: • Sonde TaqMan • Molecular Beacon • SYBR Green

13. Sonde TaqMan • Sonda oligonucleotidica complementare alla sequenza target, interna ai primers di PCR • La sonda è marcata con un fluoroforo ad una estremità ed un quencher all’altra La distanza tra fluoroforo e quencher è tale da bloccare l’emissione di fluorescenza.

14. Sonde TaqMan:come funzionano • Denaturazione: nessuna fluorescenza • Annealing: la sonda lega la sequenza target, ma non si sviluppa fluorescenza • Estensione: l’azione dalla polimerasi prima sposta l’ estremità 5’ della sonda, e quindi stacca la molecola reporter mediante l’ attività esonucleasica 5’-3’.Il reporter è libero dal quencher, emette fluorescenza, e si accumula ad ogni ciclo. • Lettura della fluorescenza (Plate Read): in qualsiasi fase

15. Molecular Beacons • Sonda oligonucleotidica a forma di forcina • L’ oligo ha un fluoroforo ad una estremità ed un quencher all’ altra Il loop è complementare alla sequenza target, interna ai primers di PCR Lo stem è costituito dalle estermità complementari tra loro In assenza della sequenza target, la sonda rimane chiusa e il quencher blocca l’ emissione del vicino fluoroforo.

16. Molecular Beacons: come funzionano • Denaturazione: fluorescenza non specifica dovuta a denaturazione della sonda • Annealing: si sviluppa fluorescenza solo se la sonda ibrida con il target specifico • Estensione: la sonda si dissocia dal target • Lettura della fluorescenza (Plate Read): in fase di annealing Se la sonda è disegnata correttamente, è sufficiente il mismatch di una sola base per impedire l’ ibridazione con il target. Applicazione: SNP

17. SYBR Green ss DNA ds DNA Taq polymerase SYBR Green Il SYBR Green si lega al DNA a doppio filamento, in modo non dipendente dalla sequenza. (si lega ai dimeri di primer, si lega ai prodotti di amplificazione aspecifici) Il legame al dsDNA determina una forte emissione di fluorescenza (eccitazione 488 nm, emissione 520-530 nm), proporzionale alla quantità di amplificato. • Denaturazione: nessuna fluorescenza • Annealing: si sviluppa fluorescenza con l’accumulo dell’ amplificato • Estensione: si sviluppa fluorescenza con l’accumulo dell’ amplificato • Lettura della fluorescenza (Plate Read): in fase di annealing o, di solito, in fase di estensione.

18. Q A C FAM Allelic Discrimination Assay For Allele 1 - only VIC™ dye signal is generated VIC Q G C For Allele 2 - only FAM™ dye signal is generated FAM VIC Q Q G T A T

19. GENOTYPING DNA MUTATON SCREENING SSCP, HMA, OLA, CC POPULATION SCREENING FORENSIC, STR, RAPD, AFLP PCR LINKAGE ANALYSIS MICROSATELLITES