Microscopia de contraste diferencial de fase

1. Microscopia de contraste diferencial de fase

2. Contraste diferencial de fase • Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo. Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão) fluorescência refração absorção LUZ reflexão

3. Contraste = (If - Ia) x 100 If Contraste diferencial de fase • Conceito Técnica de contraste em que a luz plana polarizada incidente sobre a amostra passa por diferentes caminhos ópticos em pontos diversos da amostra, causando diferenças de intensidade de luz que passam por um 2º polarizador. Os caminhos ópticos diferentes podem ser causados por diferenças nos índices de refração e/ou nas espessuras das estruturas. I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).

4. Contraste diferencial de fase • Indicações - Amostras vivas ou fixadas não coradas; • Observação de células (incluindo organelas) em cultura: • Aplicar coloração óptica; • Melhorar contraste de certas estruturas em amostras coradas; • Aplicação da técnica de seccionamento óptico.

5. Contraste diferencial de fase • Configurações 1) Tradicional (Normanski, 1952): usa prismas Wollaston e polarizadores. Também conhecida como conatrste de Normanski. 2) Alternativa (Inoué, 1989): usa polarizadores e compensadores de retardo de fase. Também conhecida como técnica DIC com compensador de fase. Pode-se usar compensador de Senarmont, compesador de Berek ou filtro l com analisador giratório.

6. Contraste diferencial de fase • O que o contraste diferencial faz? - Variações nos caminhos ópticos dos raios desviados são ajustadas para dar um contraste com impressão de imagem tridimensional; - partes da amostra podem ficar mais escuras ou mais claras que o campo de visão ao redor. - não há halos de fase ao redor das células/estruturas; - produz melhor resolução do que o contraste de fase pela ausência dos anéis de fase nas objetivas e condensador; - há formação de sombras acompanhando um eixo no plano da imagem.

7. Contraste diferencial de fase • Configuração tradicional Analisador Wollaston Wollaston Filtro 1/4 l Polarizador Trabalha-se nos planos da imagem conoscópica

8. Contraste diferencial de fase • Configuração alternativa (de Senarmont) Analisador Compensador de Senarmont: Consiste num filtro ¼ de l e um polarizador (pode ser o analisador) giratório. Objetiva Amostra Diafragma do condensador Filtro ¼ de l Polarizador giratório Fonte de luz

9. Contraste diferencial de fase • Configurações de compensador de Senarmont Controle Giratório removível Analisador Analisador Trava Graduação de 180 ou 360º Filtro de ¼ de l Fenda para inserir filtro Escala vernier (a) (b)

10. Contraste diferencial de fase • Configuração alternativa (de Senarmont) • 1) Faz-se ajuste koehler; • 2) coloca-se polarizadores cruzados, com • o 1º na posição 45º e o 2º a 90º do 1º • (campo de visão fica escuro); • 3) Insere-se o filtro ¼ de l na fenda apropriada;

11. Contraste diferencial de fase • Configuração alternativa (de Senarmont) • 4) Gira-se o analisador até criar um retardo de fase adequado para se obter o melhor contraste para cada caso. O retardo de fase é dado por: l*q/180 (q é o angulo movido no analisador).

12. Contraste diferencial de fase • Configuração alternativa (de Senarmont) • 5) Pode-se inserir um filtro vermelho 1 (entre o polarizador e a amostra ou entre a objetiva e o analisador) para fazer coloração óptica.

13. Contraste diferencial de fase • Configuração alternativa (de Senarmont) • É mais prática que a configuração tradicional e está sendo responsável pela crescente popularidade da técnica de DIC.

14. Contraste diferencial de fase • Eixos das sombras

15. Contraste diferencial de fase • Dados técnicos • Acessórios obrigatórios (método alternativo): dois polarizadores (sendo um deles giratório) e um filtro de ¼ de l ou filtro l; ou compensador de Berek. 2) Acessórios extras (método tradicional): prismas Wollaston (no diafragma do condensador e perto do plano retro-focal da objetiva) (para a técnica clássica de DIC).

16. Contraste diferencial de fase • Técnicas e contraste Amostra Técnica Contraste Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25% Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%

17. Contraste diferencial de fase • Técnica de coloração óptica Sem filtro vermelho 1 Com filtro vermelho 1

18. Contraste diferencial de fase • Secionamento óptico • É a técnica de observar planos específicos da amostra separadamente, trabalhando com o ajuste micrométrico em certas técnicas de contraste. Observação de diversos planos de uma colônia de Volvox (microorganismos aquáticos)

19. Contraste diferencial de fase • Contraste de fase x DIC: diferenças DIC Contraste de fase