Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine

1. GUILBOT Nils ISMANJulien KONCKI Arielle POMATTOLaurianne POUJOL Julie Molécule de créatinine Source: wikipédia Test papier pH Source: www.teesfrance.com Projet de Biologie:Mesure in vitro de la créatinine Soutenanceprojetcréatinine - 13/05/2011

2. Plan Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Qu’est ce que la créatinine? La détection de la créatinine La réaction de Jaffé Test de dépôt sur papier Test de dépôt sur microbilles Test sur gel d’agarose Bilan, perspective et coût du projet

3. I. Qu’est ce que la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

4. Qu’est ce que la créatinine? Soutenanceprojetcréatinine - 13/05/2011

5. Qu’est ce que la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Taux constant, hors effort • Dégradation par les reins et évacuation dans l’urine • Concentration sanguine faible (30 mg/L) • Gamme de valeurs de concentration chez l’homme :

6. II. La détection de la créatinine Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

7. Pourquoi vouloir détecter la créatinine? Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • L’insuffisance rénale • 3 millions de personnes touchées • La filtration glomérulaire n’est plus assurée • Augmentation de la créatinine sanguine • Diminution de la clairance

8. Comment on la détecte? Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Où trouve-t-on la créatinine? • Sang : méthode actuelle • Urine : on doit détecter une diminution de la clairance • Salive : méthode la plus simple • Actuellement, on mesure la créatinine par voie sanguine • Méthode invasive • Problèmes à long terme • Obligation de faire appel au personnel médical

9. Avantage de détecter la créatinine dans la salive Soutenanceprojetcréatinine - 13/05/2011 • Méthode non invasive • Aucun problème de contamination • Possibilité de faire le test soi même, à la maison • Résultat quasi immédiat

10. Objectifs initiaux Soutenanceprojetcréatinine - 13/05/2011 • Trouver une méthode de mesure de la créatinine • Moins invasive • Moins contraignante • Moins chère • Test papier

11. III. La réaction de Jaffé Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

12. La réaction de Jaffé Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Simple Avec une cinétique de réaction Mais réaction sensible à différents facteurs (sérum: drogue, glucose ….)

13. La Gamme de concentration Soutenanceprojetcréatinine - 13/05/2011 Nécessité d’avoir 1/3 créatinine 1/3 acide picrique 1/3 soude Volume puits: 200µL Cinétique: 15 minutes Extension de la gamme

14. La Gamme de concentration Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

15. La Gamme de concentration Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Décalage de la gamme de concentration => zone à risque dans la zone de virage de la couleur.

16. La Gamme de concentration Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Gamme décalée Mais écart réduit

17. V. Test de dépôts sur papier Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

18. Test de dépôts sur papier Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Objectifs : • Etude du comportement des liquides sur les différents papiers • Détermination d’un papier optimal pour la réaction • Etude de la réaction : visualisation de la couleur • Protocole expérimental : • Dépôt d’une goutte de 10 μL de picrate • Choix du papier optimal pour la réaction • Dépôt d’une goutte de 5μL de créatinine à 800 μM

19. Test de dépôts sur papier Papier blanc épais Papier carton face 2 Papier carton face 1 Calque Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Dépôt d’une goutte de 10μL de picrate : • Test sur 10 papiers différents : plus ou moins absorbant • Dépôt sur chaque face des papiers • Résultats :

20. Test de dépôts sur papier Goutte de picrate Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Analyse des résultats : • Dépôts de couleur différente selon les papiers • Diffusion différente entre deux papiers différents • Diffusion différente entre les faces d’un même papier • Pénétration plus ou moins lente dans les papiers : immédiatement 30 minutes • Contour plus foncé des gouttes : conséquences sur la réaction?

21. Test de dépôts sur papier Limite picrate On observe un liseré orangé : Réaction qui se produit ? Limite créatinine Diffusion des molécules Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Dépôt d’une goutte de 5 μL de créatinine à 800 μM : • Choix des papiers où la goutte de picrate a pénétré rapidement • Résultats :

22. Test de dépôts sur papier Différence aisée pour public non averti ? VS picrate picrate + créatinine Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Analyse des résultats : • Molécules de picrate chassées par la goutte de créatinine • Présence d’un liseré orange : la réaction « semble » se produire • MAIS faux positif ?

23. Test de dépôts sur papier • Diffusion homogène dans le papierGoutte de picrate : • Couleur jaune • Couleur homogène • Réaction semble se produire MAIS diffusion des molécules de picrate par la créatinine Méthode pour les fixer sur le papier Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Cependant un espoir : le papier n° 7 • Papier standard créé par les élèves de Pagora en TP • Pénétration du liquide dans le volume

24. V. Tests de dépôt sur micro billes Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

25. Colonne PD 10 • Elimination du tampon par Lavage • Saturation de la colonne en picrate microbilles poreuses imbibées de picrate Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

26. Observation au microscope Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

27. Réalisation d’une gamme sur billes Changements de couleur peu discernables entre 0 et 600 μMolaires. Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 50 mg de mélange bille/picrate+15 μlitres de créatinine à différentes concentrations

28. Expériences et résultats complémentaires Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 - La réaction ne marche que sur des billes humides • La réaction marche que les billes soient mises au frais ou laissées à l’air ambiant. - La réaction est limitée dans le temps: les billes redeviennent jaune clair après quelques heures

29. Combinaison billes papier Sur papier peu diffusif: 50 mg mélange Billes picrate + 15 μlitres de Créatinine Concentration Créatinine (μmolaires) 200 400 600 800 Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

30. Combinaison billes papier Sur papier diffusif: Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

31. Une limite: la fixation des billes • Scotch : Peu efficace • Colle scolaire : empêche la réaction Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

32. VI. Test sur gel d’agarose Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

33. Comment empêcher le dessèchement des billes ? Si le billes restent en contact avec l’air Assèchement du picrate et absence de réaction après ajout de créatinine Problème de conservation du test Conclusion: nécessité d’isoler les billes de l’air Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

34. Effectuer la réaction dans un gel d’agarose Agarose 0,5% Puits1 : gel 60μL + picrate en solution 60μL Puits2 : billes (50mg) + gel 60μL Puits3 : mélange homogène billes + gel 60μL Ajout de 30 μL de créatinine après solidification du gel Agarose 0,25% Puits1 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 50μL créatinine Puits2 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 25μL créatinine Stœchiométrie 2/3, picrate 1/3 créatinine

35. Résultats Agarose 0,5% Puits1 : la réaction a lieu => coloration orangée Puits2 : billes au fond du puits, présence d’une couche de gel en surface => le gel s‘est-il glissé entre les billes? La créatinine ne semble pas pénétrer le gel Puits3 : pas de coloration, la créatinine ne pénètre pas le gel Agarose 0,25% Puits1 : coloration orangée au bout de 15-30min Puits 2 : idem

36. Réalisation d’une gamme colorimétrique Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 réalisation d’une gamme colorimétrique sur gel d’agarose mélangé à 50μL de picrate en solution Ajout de créatinine de 300 à 1000mM

37. Test de conservation Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Réalisation de la même gamme colorimétrique après 48h de repos du mélange gel+picrate La réaction a lieu mais intensité très faible => différence indiscernable.

38. Bilan L’utilisation d’un mélange picrate en solution + gel d’agarose semble être une solution exploitable. Problématique1: déplacer la gamme pour distinguer les couleurs correspondant à différentes concentrations en créatinine ? Problématique2: problème de conservation du test, inexploitable à moyen terme.

39. VII. Bilan, perspectives et coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

40. Bilan des expériences Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • Réactions sur trois types de support :

41. Perspectives du projet Dans des micro-puits Sur une bandelette Goutte de salive Analyse Gel d’agarose + picrate Gel d’agarose + picrate salive Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • A développer : • Fixation du picrate sur le papier : Structure du picrate à étudier • Réaction dans le gel d’agarose : Conditionnement du gel pour faciliter le test

42. Coût du projet Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

43. Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 Merci de votre attention !

44. bibliographie Soutenance projet créatinine - 13/05/2011 • An Enzymic Reaction-Rate Assay for Serum Creatinine with a Centrifugal Analyzer, Patrick K. Jaynes, Ronald D. Feld, and George F. Johnson • EnzymicCreatinine Assay: A New Colorimetric Method Based on Hydrogen Peroxide Measurement, PieroFossati, Lorenzo Prencipe, and Giovanni Bert • Kinetic Enzymatic Method for Determining Serum Creatinine, Gerald A. Moss, Richard J. L. Bondar, and Diane M. Buzzelli • Direct detection of renal function markers using microchip CE with pulsed electrochemical detection, Carlos D. Garcia and Charles S. Henry • Method for the microassay of endogenous creatinine in blood and urine of small murid rodents, S. HEWITT • Mechanism of Interference with the Jaffé reaction for Creatinine, Martin H. Kroli, Nell A. Roach, Brent Poe, and Ronald J. EIIn • Reaction of Alkaline Sodium Picrate with Creatinine: Kinetics and Mechanism of Formation of the Mono-Creatinine Picric Acid Complex John Vasillades