1 / 68

PCR 技术

PCR 技术. 课程安排. PCR 扩增 ： 人HLA-DR B 基因 （基因组 DNA 为模板） 人 β-actin 基因（ cDNA 为模板） PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析（ β-actin ） PCR产物 的 SSCP－PAGE分析 （ HLA-DR B ）. PCR 基本原理及相关知识. 概念 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ， PCR ）是一种体外扩增特异 DNA 片断的技术 , 能在短时间内获得数百万个特异 DNA 序列的拷贝。.

tannar
Download Presentation

PCR 技术

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PCR技术

  2. 课程安排 • PCR扩增： 人HLA-DRB基因（基因组DNA为模板） 人β-actin基因（cDNA为模板） • PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（β-actin） • PCR产物的SSCP－PAGE分析（HLA-DRB）

  3. PCR基本原理及相关知识 • 概念 • 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。

  4. PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的。 • Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。 Kary Mullis

  5. 相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强； 广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。

  6. PCR扩增DNA片段的原理 PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：

  7. ①变性：加热，模板DNA形成两条单链 ② 退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合 ③ 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下， 引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链

  8. 上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109 倍。 通过循环可以提高PCR的特异性。

  9. PCR反应体系的组成及功能 一个完整的PCR反应体系应包括以下成分： 引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，PCR引物设计的原则：1~7；目的是提高扩增的效率与特异性。 终浓度为0.1~0.5umol/L

  10. 引物设计的一般步骤及其原则 • 获取目的基因序列，http://www.ensembl.org/或者http://www.genome.ucsc.edu • 采用引物设计软件如Primer premier 5.0、Oligo 6.0获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。 • 按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。 • ① 一般评分大于80 • ② 扩增产物长度 以200-500bp为宜， • ③ G+C的含量在40~60%之间，正向引物、反向引物以及内参引物的G+C含量和 Tm值应接近

  11. ④ 引物长度一般18~27bpATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 • 3`端第一个碱基尽量不要是A，也不要出现3个以上的连续碱基序列，如GGG等，3`端与模板严格配对。 • 尽量减少发夹结构和引物二聚体的形成，特别是在引物的3`端 • Primer 5’未端可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶识别位点），但绝不可以在3‘端进行这些改造。 • RT-PCR两引物间序列要跨一个内含子 • 设计好后对引物进行数据库blast，应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 　

  12.  Taq DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，而无3'→5'外切活性，它不具有Klenow酶的3'→5'校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的.Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4.其活性对Mg2+浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul

  13.  模板DNA 相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。 模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。  dNTP(dATP dCTP dGTP dTTP) 已有商品化的混合液，终浓度一般为20~ 200umol/L。

  14. 10×PCR反应buffer： 已作成商品化的产品，它包括： 250~500mmol/L KCl； 100~500mmol/LTris-HCl（pH8.4）；15~20mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~ 2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）； 0.1%明胶或牛血清白蛋白

  15.  dd H2O 调节反应体积  液体石蜡油 （PCR仪有热盖则不用加）

  16. 影响PCR的主要因素 ①PCR反应体系的各个组分 ②PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸） ③PCR循环的次数和平台效应 ④操作环境

  17. 平台效应及其原因

  18. 实验一 PCR

  19. 常用的PCR反应体系： 10×PCR Buffer 5ul 上下游引物（25μM） 2ul dNTPs （2.5mM） 4ul Taq DNA聚合酶 0.5ul（2U） 模板DNA 0.1至1ug ddH2O 补足体积至50ul

  20. 实验操作及注意事项 实验试剂： 2×PCR Mix : Taq酶，四种dNTP，PCR反应buffer 引物：上下游特异性引物 水（dd H2O）：用以补足体积 基因组DNA cDNA

  21. 建立PCR反应体系 1. 扩增β-actin基因 β-actin引物2 l cDNA 4l 2×PCR Mix 15l 水9 l total volume 30l

  22. 2. 扩增 HLA-DRB 基因 HLA-DRB引物 2 l 基因组DNA 4l 2×PCR Mix 15l 水9 l total volume 30l

  23. 此步注意事项： 1. 每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染 2. 避免重复加样或漏加样。 3. 加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。 4. 加完试剂后离心将液体汇集管底。 5. 对没有热盖的PCR仪要加封石蜡油。

  24. 扩增β-actin基因程序的建立 预变性 94℃5min 变性 94℃45s 复性 59℃45s 延伸 72℃1min 续延伸 72℃10min 保存 4℃ 30 cycles

  25. 扩增 HLA-DRB 基因程序的建立 预变性 94℃5min 变性 94℃45s 复性 55℃45s 延伸 72℃1min 续延伸 72℃10min 保存 4℃ 35 cycles

  26. 实验二DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA

  27. 常用DNA分析技术 定性分析：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳、southern-blotting、芯片技术等 定量分析：分光光度法、荧光分光光度法 序列分析：末端终止法、化学裂解法

  28. 一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳 • 电泳及其基本原理 • 常用的电泳方法 • 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）

  29. 利用物质的两个差异来分离物质 电荷差异 电荷性质 电荷数量 分子差异 分子大小 分子形状

  30. 二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳 • 电泳及其基本原理 • 常用的电泳方法 • 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）

  31. 三、DNA琼脂糖凝胶电泳原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的。

  32. 四、DNA琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 实验目的及意义 1. β-actin基因扩增产物的鉴定 2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳实验方法

  33. 实验材料及试剂 材料：β-actin基因扩增产物 试剂： 1% 琼脂糖凝胶（配制方法） 电泳缓冲液： 1TAE （ 10  上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油） 溴化乙锭 （其它荧光染料如花青类染料 SYBR Green I 及GoldView等）

  34. 实验操作及注意事项 琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳） 琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极） β-actin 扩增产物10ul＋2ul上样缓冲液 (每块胶留一孔加Maker10ul)，电泳（100V,约1h） 紫外检测

  35. 400bp 300bp 200bp 100bp 50bp

  36. 实验三 PCR产物SSCP－PAGE分析

  37. SSCP-PAGE原理 • 单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而在电场中迁移率不同，在聚丙烯酰胺凝胶中分子筛效应不同。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，为DNA单链构象多态性 (Single-Strand Conformation polymorphism，SSCP)分析. • SSCP-PAGE检查PCR扩增产物的基因突变十分广泛。

  38. SSCP-PAGE特点 1．DNA长度为150-300bp(本实验中HLA-DRB扩增片断为227bp)突变体检出效率最高。 2．理论上讲SSCP能够100%的检测出突变体。(70—80%) 3. 要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序

  39. PCR-SSCP基本过程 1．PCR扩增靶DNA。 2．PCR产物的快速变性而后快速复性，形成特定 空间结构的DNA单链分子。 3. 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 4. PAGE胶的银染

  40. PCR-SSCP结果判定 • 单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，存在碱基突变. • 有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别,因此一般要求电泳长度在16--18cm以上. • 以检测限为指标来判, 检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值,一般检测限定为3mm。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化。

  41. SSCP-PAGE应用 • 在遗传学方面的有广泛的应用， • 例如，癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查， • 遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断， • 法医的亲子鉴定和个体识别。

More Related