第六章好氧发酵产物积累机制

第六章好氧发酵产物积累机制 好氧性发酵(aerobic fermentation)：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、利用黄单孢菌进黄原胶－多糖的发酵等等．糖的分解代谢包括糖酵解（糖的共同分解途径）和三羧酸环（糖的最后氧化途径）。

在有氧条件条件下： • 丙酮酸进入线粒体，脱氢和脱羧生成乙酰COA，在TCA循环中脱氢，并氧化形成CO2和 H2O，或者各种代谢物，NADH2经呼吸链将氢传递给氧生成水。 • 另外，乙酰辅酶A在生物合成过程中作为C2化合物加以利用，形成脂肪等。

第一节柠檬酸的发酵机制 • 一、柠檬酸的合成途径 • 黑曲霉 (Asp.niger) • 原料：sugar ，alcohol， acetic acid • 途径： EMP（HMP） • 丙酮酸羧化 • TCA环 • 黑曲霉生长，EMP与HMP途径的比率是2：1，生产柠檬酸时为4：1。 • 葡萄糖柠檬酸(citric acid) • 理论转化率106.7% R

目的产物 提供4C化合物 TCA循环

AMP Pi NH4+ ATP citrate NH4+ k+ CO2 阻断激活抑制柠檬酸的生物合成途径 2 1

CO2 • 二、柠檬酸生物合成的代谢调节积累柠檬酸应采取的措施：　想方设法提高柠檬酸合成反应所需酶的活力；　必须切断柠檬酸的去路；顺乌头酸酶失活，　　　　　　　　　　　　ＴＣＡ环阻断。　保证中间产物的供给；草酰乙酸的及时供给，　　　　丙酮酸　　　二氧化碳固定反应对柠檬酸　　积累有重要意义。 CO2 　乙酰COA　草酰乙酸　　　　　　　　　

1 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 • 第一个调节的酶是磷酸果糖激酶（PFK）：AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用 • ATP、柠檬酸对该酶有抑制作用 Q：PFK在正常生理条件下能被柠檬酸抑制，但在柠檬酸发酵中，柠檬酸浓度很高，为什么EMP途径仍能保持畅通呢？

由于TCA循环降低，ATP的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK的抑制。由于TCA循环降低，ATP的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK的抑制。 • 柠檬酸发酵需要下述环境条件：磷酸盐浓度低；氮源为NH4+盐； pH值低（低于2.0）；溶氧量高；Mn2+、 Fe2+ 、Zn2+含量极低。 • 　　柠檬酸发酵中黑曲霉对Mn2+极端敏感。黑曲霉在缺锰的条件下发酵，细胞有生理和代谢的变化。 • Mn2+的效应可以认为是NH4+水平升高而减弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。

第二个调节的酶是丙酮酸激酶（PK） 　 PK 被NH4+、K+激活磷酸烯醇丙酮酸－－－－丙酮酸＋ATP • 二氧化碳的固定反应参与二氧化碳固定反应的酶：丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

2 TCA环的调节 • 柠檬酸合成酶是该途径的第一个限速酶，由乙酰辅酶Ａ中的高能硫酯键水解释放大量能量，推动合成柠檬酸。 • 柠檬酸　　　顺乌头酸　　　异柠檬酸两步反应均由顺乌头酸酶催化，该酶需要Fe++， I 若用络合剂除去反应液中的铁，则酶活性被抑制，造成柠檬酸的积累。

II 阻断顺乌头酸酶的催化作用：该酶是个含铁的非血红蛋白，以Fe4S4作为辅基。因此，在菌体生长到足够菌数时，适量加入亚铁氰化钾（黄血盐），使与铁硫中心的Fe++生成络合物，则该酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。 • III 通过诱变或其他方法，造成生产菌种顺乌头酸酶的缺损或活力很低，同样积累柠檬酸。 3 及时补加草酰乙酸　　外加草酰乙酸　选育回补途径旺盛的菌种。

柠檬酸积累机理 • 1、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高，促进了EMP途径的畅通。 • 2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。 • 3、在控制Fe++含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90 ：3：7

4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ和丙酮酸固定CO２反应相平衡，以及柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ和丙酮酸固定CO２反应相平衡，以及柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。 • 5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。

第二节醋酸发酵机制 • 淀粉糖酒精醋酸 • 1. 醋杆菌发酵酒精成醋酸 • 乙醇向醋酸转化是分两步进行的，中间产物是乙醛。 • CH3CH2 OH E1CH3CHO E2 CH3COOH • E1乙醇脱氢酶或乙醇氧化酶，它依赖于NAD。 • E2 乙醛脱氢酶，需要NADP作辅酶。 • 醋杆菌为G-，好氧菌， • 1mol乙醇转化为1mol醋酸，理论转化率是130％。

2 热醋酸梭菌生产醋酸 热醋酸梭菌在发酵糖类时，由糖到醋酸一步完成，还可以将CO2还原为醋酸。 CO2是通过甲酰四氢叶酸（THF）和类咕啉蛋白形成醋酸的。但该菌没有氢化酶活性，不能利用氢气。 C6H12O6 +2H2O 2CH3COOH+2CO2+8H++8e 2CO2+8H++8e CH3COOH+ 2H2O 净反应　　C6H12O63CH3COOH 　　反应在厌氧条件下进行的，由己糖或戊糖生成醋酸的理论产率都是100％。　　热醋酸梭菌为产芽孢菌，Ｇ＋，周生鞭毛，耐高温，最适生长温度55～60°C，转化率高，严格厌氧，还可以利用戊糖。但这种方法发酵时需中和剂，因此只适合于醋酸盐。

第三节谷氨酸发酵机制 氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键是取决于其控制机制是否能够被解除，是否能打破微生物的正常代谢调节，人为地控制微生物的代谢。

一.谷氨酸生物合成途径 谷氨酸的生物合成途径有EMP途径、HMP途径、 TCA循环、乙醛酸循环和CO2固定反应。葡萄糖先生成谷氨酸，依次经鸟氨酸，谷氨酸生物合成精氨酸。谷氨酸的生物合成途径如图所示。

二.谷氨酸生物合成的调节机制

三. 谷氨酸发酵的代谢控制 谷氨酸发酵的代谢控制一般采取下列措施。 1．控制发酵的环境条件氨基酸发酵受菌种的生理特征和环境条件的影响，对专性好氧菌来说，环境条件的影响更大。谷氨酸发酵必须严格控制菌体生长的环境条件，否则就几乎不积累谷氨酸。下表表示谷氨酸生产菌因环境条件改变而引起的发酵转换，这也就是说氨基酸发酵是人为地控制环境条件而使发酵发生转换的一个典型例子。

2．控制细胞膜渗透性 在发酵过程中，控制使用那些影响细胞膜通透性的物质，有利于代谢产物分泌出来，从而避免了末端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。以葡萄糖为原料，利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸时，谷氨酸生产菌为α-酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，当谷氨酸的合成达到50 mg/g（干细胞）时，由于反馈调节作用，谷氨酸的合成便终止。如果改变细胞膜通透性，使胞内代谢产物谷氨酸渗透到胞外，有利于提高发酵产量。

所以代谢产物的细胞渗透性是氨甚酸发酵必须考虑的重要因素。对于谷氨酸发酵来说，生物素是谷氨酸发酵的关键物质。当细胞内的生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，因而得不到谷氨酸。所以代谢产物的细胞渗透性是氨甚酸发酵必须考虑的重要因素。对于谷氨酸发酵来说，生物素是谷氨酸发酵的关键物质。当细胞内的生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，因而得不到谷氨酸。谷氨酸发酵生产中，谷氨酸生产菌菌属于生物素缺陷型菌种，生物素作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。

因而可以通过限量控制生物素的含量，也就是通过控制生物素亚适量，提高细胞膜的渗透性。因而可以通过限量控制生物素的含量，也就是通过控制生物素亚适量，提高细胞膜的渗透性。在发酵的前期，满足细胞的生长，合成完整的细胞膜；中期生物素耗尽，细胞膜合成不完整，完成长菌型细胞向产酸型细胞的转变，细胞膜的渗透性增加，使得谷氨酸渗透到细胞外，在细胞内谷氨酸达不到引起反馈调节的程度，从而使谷氨酸能够源源不断被优先合成。

影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质可分为两大类：影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质可分为两大类：一类是生物素、油酸和表面活性剂，其作用是引起细胞膜的脂肪酸成分或量的改变，尤其是改变油酸含量，从而改变细胞膜通透性；另一类是青霉素，其作用是抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。另外，代谢控制还包括控制支路代谢，消除终产物的反馈抑制和反馈阻遏等等。

三、现有谷氨酸生产菌的主要特征 从细菌的鉴定和分类的结果来看，现有谷氨酸生产菌分属于捧状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属，但是它们在形态及生理方面仍有许多共同的特征。归纳起来主要有以下特征。（1）细胞形态为球形，棒形以至短杆形。（2）革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动。（3）都是需氧型微生物。（4）都是生物素缺陷型。（5）脲酶强阳性。（6）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶等。（7）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。

（8）CO2固定反应酶系活力强。 （9）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循坏弱。（10）α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱。（11）还原型辅酶Ⅱ（NADPH2）进入呼吸链能力弱。（12）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。（13）能利用醋酸，不能利用石蜡。（14）具有向环境中泄漏谷氨酸的能力。（15）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5%以上。

第五节抗生素发酵机制 次级代谢产物---(secondary metabolite) 代谢类型分解代谢：将从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降解，为细胞的生命活动提供能源和小分子中间体。如TCA、EMP和HMP等。合成代谢：利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。

初级代谢和次级代谢 初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。次级代谢：某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素，其它还有氨基糖、香豆素、麦角生物碱、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉等。

一、次级代谢产物的特征 １、次级代谢产物是由微生物产生，不参与微生物的生长与繁殖。　２、次级代谢产物的生物合成最少也要有一部分取决于与初级代谢产物无关的遗传物质，并与由这类遗传信息形成的酶所催化的代谢途径有关。　３、它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。　４、次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和产物形成期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。待到细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，成为生产期。

５、一般都同时产生结构上相类似的多中副组分。５、一般都同时产生结构上相类似的多中副组分。６、生产能力受微量金属离子（Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+）和磷酸盐等无机离子的影响。７、在多数条件下，增加前体是有效的。８、次级代谢酶的底物特异性在某种程度上说是比较广的。若提供底物结构类似物，则可得到与天然物不同的次级代谢物。９、培养温度过高或菌种移植次数过多，使抗生素生产能力下降，可能的原因是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落。１０、一种产物可由多种中间体和途径来取得。

二、生物合成抗生素与初级代谢的关系 1.从代谢方面分析：　　许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切联系的。糖代谢的中间体，即可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体，如丙二酰CoＡ。 G 乙酰 CoＡ丙二酰 CoA 　　　脂肪酸（初级）　　　　　　　　　　　四环素或其他抗生素（次级）

初级代谢和次级代谢的分叉中间体 分叉中间体　　初级终点产物　　次级终点产物氨基己二糖　　赖氨酸　　　青霉素,头孢酶素　　　丙二酰CoＡ　　　脂肪酸　　　　四环素族,利福霉素族乙酰CoＡ大环内酯族,多烯族抗生素莽草酸　　　对氨基苯丙氨酸　　　氯霉素,绿脓菌素　　　　　　苯丙氨酸,酪氨酸　　　新生霉素　　由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种：葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其它复合途径。

2.从遗传方面分析： 初级产物和次级产物同样都受到核内DNA的调节控制的。　　所不同的是次级代谢产物还受到“与初级代谢产物合成无关的遗传物质”的控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制,因而产生了质粒遗传的观点。当然也有只由染色体DNA控制的抗生素。　　因此，两者在遗传上既有相同的部分，又有不同的部分。

三抗生素生产菌的主要代谢调节机制 微生物的代谢调节机制可从DNA水平研究酶合成的调节机制和从酶化学观点研究酶活性的调节机制两方面着手，可分为： • 受DNA控制的酶合成的调节机制，包括酶的诱导和酶的阻遏（有终点产物和分解产物）； • 酶活性的调节机制，包括终点产物的抑制或活化，利用辅酶的酶活调节、酶原的活化和潜酶的活化； • 细胞膜透性的调节；

微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节。次级代谢产物生物合成的调节与初级代谢产物生物合成的调节在某些方面是相同的，也是调节参与生物合成的酶合成（诱导或阻遏）和控制酶活性（激活或抑制）。但次级代谢的调节也有其独特的一面。以下是影响抗生素合成的主要代谢调节机制。微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节。次级代谢产物生物合成的调节与初级代谢产物生物合成的调节在某些方面是相同的，也是调节参与生物合成的酶合成（诱导或阻遏）和控制酶活性（激活或抑制）。但次级代谢的调节也有其独特的一面。以下是影响抗生素合成的主要代谢调节机制。

1 初级代谢对次级代谢的调节 次级代谢产物的合成途径并不是独立存在的，而是与初级代谢产物合成途径间存在着紧密的联系。次级代谢产物往往都是以初级代谢产物为母体衍生而来的，而且催化特殊次级代谢产物合成反应的酶也可以从那些初级代谢途径的酶演化而来。因此，微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。

当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体α-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制α-氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。

2 碳代谢物的调节 一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物的生物合成都表现出抑制作用。这种抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的结果，而是由于其代谢过程中产生的中间产物引起的。这种阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。

20世纪40年代初期就发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利用最快，但对青霉素合成并不适宜。而乳糖利用虽然较为缓慢，却能提高青霉素产量。20世纪40年代初期就发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利用最快，但对青霉素合成并不适宜。而乳糖利用虽然较为缓慢，却能提高青霉素产量。已知有许多次级代谢产物，如麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素、丝裂霉素、杆菌肽、新生霉素、放线菌素和香豆素等的生物合成都受到葡萄糖的阻遏，因而在这些产物的发酵过程中常采用其他碳源。

3 氮代谢物的调节 许多次级代谢产物的生物合成同样受到氮分解产物的影响。对不同氮源的研究发现，黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；而以无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源（铵盐、硝酸盐、某些氨基酸）时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。例如，易利用的铵盐有利于灰色链霉菌迅速生长，但对链霉素合成则是最差的氮源。

4 磷酸盐的调节 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。

★已发现过量磷酸盐对四环素类、氨基糖苷类、多烯类和大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。★已发现过量磷酸盐对四环素类、氨基糖苷类、多烯类和大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度≥ 10mmol/L 往往对次级代谢产物的合成有抑制作用例如， 10mmol/L的磷酸盐就能完全抑制杀假丝菌素的合成。

★ 磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。如金霉素、万古霉素等的发酵都有这些现象。 ★ 磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。

5 ATP调节 ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。在四环素的生物合成中，ATP水平对四环素合成起调节作用。磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，再经羧基转移酶作用生成丙二酰CoA（四环素合成的前体），此途径在四环素合成期起决定作用。而草酰乙酸是三羧酸（TCA）循环中的重要中间产物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量磷酸盐的强烈抑制，从而降低了草酰乙酸的生成，最终降低了四环素生物合成前体丙二酰CoA的浓度，影响四环素的生物合成。

6 酶的诱导调节 结构酶：是菌体生长繁殖所必需的酶系，它的产生一般不受培养基成分的影响；诱导酶：是在一定的诱导物存在下，才能形成。在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，如链霉素生物合成中的转脒基酶、甘露糖链霉素酶等。诱导酶需要有诱导物存在才能形成。诱导物起诱导作用，能提高次级代谢产物的产量。例如，蛋氨酸能提高头孢菌素C的产量，其原因是蛋氨酸的诱导作用，而不是作为硫源的供给物。诱导酶合成的诱导剂有些需外源加入，而有些是菌体代谢过程中自身产生的。在抗生素的发酵过程中，有的初级代谢产物似乎对次级代谢产物的合成酶也起诱导作用。

7 反馈调节 反馈调节包括反馈阻遏和反馈抑制。反馈阻遏（feedback repression)：作用于基因水平，控制酶的合成量，是终产物抑制生物合成途径中的一种或多种酶形成的调节过程。反馈抑制 (feedback inhibition)：作用于分子水平，控制酶的活性，是合成途径的终点产物抑制该过程中第一步酶的活性作用。两者作用方式各异，功能也有所不同，目的都是防止产生过量的物质，保证快速有效地适应变换了的外界环境，对生长有利。

在抗生素的合成途径中， ★一方面是抗生素本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。如氯霉素、卡那霉素、泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。 ★另一方面，初级代谢和次级代谢途径是紧密相连的，初级代谢受到的反馈调节，也必然影响抗生素的合成。如缬氨酸是合成青霉素的前体，其生物合成受到反馈调节，必然对青霉素的合成有影响。

8 细胞膜通透性调节 次级代谢中也存在着膜通透性调节。菌体吸收外界营养物质或分泌细胞内的代谢物都必须经过细胞质膜的运输。如果细胞对某种物质不能运输，或是运输功能发生了障碍，将导致细胞内合成代谢的产物不能分泌出去，影响发酵产物的生成和收获；或者是细胞外的营养物质不能进入菌体或进入很少，从而影响产生菌的生长和产物的合成，造成产量下降。

第六章 好氧发酵产物积累机制