Inhibitory a aktivátory

1. Inhibitory a aktivátory

2. Inhibitory • Látky snižující rychlost enzymově katalyzované reakce • Látky nejrůznější povahy – ionty, organické i anorganické látky • Nízkomolekulární i vysokomolekulární látky • Vyvolávají buď změnu struktury molekuly enzymu, nebo konkurují substrátu

3. Klasifikace inhibitorů • Podle původu (přirozené a umělé) • Podle specifity účinku (specifické a nespecifické) • Reversibilní (možno odstranit dialysou) a ireversibilní (nemohou být odstraněny dialysou) • Podle mechanismu působení (reversibilní) - kompetitivní • nekompetitivní • akompetitivní • smíšené Rozlišení typů inhibice • Podle změn Vmax a KM u inhibované a neinhibované reakce

4. Význam inhibitorů • Regulace enzymové aktivity • Studium enzymové aktivity • Zásahy do látkové přeměny organismů - léčiva (antibiotika, cytostatika) - herbicidy, insekticidy - vojenské bojové látky

5. Kompetitivní inhibitory • Mají strukturu podobnou substrátu (buď celá molekula, nebo část uplatňující se při vazbě na enzym) • V přítomnosti inhibitoru se vytváří inaktivní komplex enzym-inhibitor • Tvorba komplexu s inhibitorem je vratná • Za přítomnosti substrátu dochází ke kompetici • Účinek inhibitoru lze zcela odstranit dostatečně vysokou koncentrací substrátu • Často využívány jako léčiva

6. Kompetitivní inhibitory

7. Kompetitivníinhibice C-OO- C-H C-H C-OO- C-OO- H-C-H H-C-H C-OO- C-OO- H-C-H H-C-H H-C-H C-OO- C-OO- H-C-H C-OO- C-OO- C-OO- Substrát Produkt Kompetitivníinhibitor Sukcinát Glutarát Malonát Oxalát Sukcinátdehydrogenasa

8. Kompetitivní inhibitory

9. Kompetitivní inhibice k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 E + I  EI KI = [E][I] / [EI] KI = inhibiční konstanta

10. Kompetitivní inhibice - kalkulace [E]tot = [E] + [ES] + [EI] [E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI [E]tot = [E] (1 + [I]/KI) + [ES] Vyjádříme [E] : [E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI) KI = [E][I] / [EI]

11. Kompetitivní inhibice - kalkulace Víme že: Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES] [E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI)  [E][S]/[ES] = KM = ([E]tot - [ES])[S] / (1 + [I]/KI)[ES] Vyjádříme [ES]

12. Kompetitivní inhibice - kalkulace [ES] = [E]tot [S] / (KM + [S] + KM[I]/KI) Analogická úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat)

13. Kompetitivní inhibice Výnos podle Lineweaver-Burka • Maximální rychlost reakce se nemění • KM se u inhibované reakce zvyšuje

14. Sulfonamidy jako kompetitivní inhibitory -COOH H2N- -SONH2 H2N- Domagk (1939) Para-aminobenzoovákyselina (PABA) Bakteriepotřebují PABA pro biosynthesu folátu Folát Tetrahydro- folát Prekursor Sulfonamidy mají podobnou strukturu jakoPABA, a inhibují bakteriálnírůst. Sulfonamidy Tato metabolická dráha pro biosynthesu folátu se nenachází u člověka!

15. Nekompetitivní inhibitory • Neovlivňují vazbu substrátu na enzym (neváží se do aktivního centra) • Snižují rychlost přeměny substrátu na produkt • Účinek inhibitoru je nezávislý na koncentraci substrátu • Mechanismus účinku je založen na alosterickém efektu (inhibitor se váže mimo aktivní centrum a mění jeho konformaci na neaktivní) • Inhibitor se váže na samotný enzym i na komplex enzym-substrát

16. Nekompetitivní inhibice

17. Nekompetitivní inhibice

18. Nekompetitivní inhibice Zjednodušující předpoklad: • Substrát neovlivňuje vazbu inhibitoru na enzym • Reakce E + I  EI a reakce ES + I  ESI mají stejné inhibiční konstanty KI

19. Nekompetitivní inhibice - kalkulace KI = [E][I] / [EI] [E]tot = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] [E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI + [ES][I] / KI [E]tot = ([E] + [ES]) (1 + [I]/KI) Vyjádříme [E] : [E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)]- [ES] KI = [ES][I] / [ESI]

20. Nekompetitivní inhibice - kalkulace Víme že: Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES] [E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)]- [ES]  [E][S]/[ES] = KM = [[E]tot / (1 + [I]/KI)][[S]/[ES]] - S Vyjádříme [ES] a provedeme analogickou úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat). Získáme výraz:

21. Nekompetitivní inhibice - kalkulace

22. Výnos podle Lineweaver-Burka Maximální rychlost inhibované reakce se snižuje KM se u inhibované reakce nemění Nekompetitivní inhibice

23. Akompetitivní inhibitory • Mohou se vázat na enzym až když vazba substrátu vhodně pozmění jeho konformaci • Nereagují s volným enzymem! • Vazbou na komplex enzym-substrát (vytvořením komplexu ESI) zabrání jeho přeměně na enzym a produkt • Hlavně u dvousubstrátových reakcí (inhibitor se váže na vazebné místo pro druhý substrát) • Existuje pouze několik případů

24. Akompetitivní inhibice

25. Akompetitivní inhibice

26. Akompetitivní inhibice Výnos podle Lineweaver-Burka • Maximální rychlost i KM se u inhibované reakce snižuje stejnou měrou

27. Inhibice enzymové aktivity (mechanismy) E + S→ES→E + P + I ↓ EI E + S→ES→E + P + + II ↓ ↓ EI+S→EIS E + S→ES→E + P + I ↓ EIS ← ← ← ↑ ↑ ↑ ↑ akompetitivní kompetitivní nekompetitivní E Substrate E X Cartoon Guide Compete for active site Inhibitor Different site Equation and Description [I] binds to free [E] only, and competes with [S]; increasing [S] overcomes Inhibition by [I]. [I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favors the inhibition by [I]. [I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] can not overcome [I] inhibition. Juang RH (2004) BCbasics

28. Inhibiceenzymové aktivity (grafy) acompetitivní kompetitivní nekompetitivní Vmax Vmax vo Vmax’ Vmax’ I Direct Plots Km [S], mM Km’ Km [S], mM 1/vo 1/vo 1/vo I I Double Reciprocal Two parallel lines Intersect at X axis Intersect at Y axis 1/Vmax 1/Vmax 1/Vmax 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] Vmax vo I I Km Km’ [S], mM =Km’ Vmax unchanged Km increased Vmax decreased Km unchanged Both Vmax & Km decreased I Juang RH (2004) BCbasics

29. Ireversibilní inhibitory • Enzym je kovalentně modifikován po interakci s inhibitorem • Typickým příkladem jsou organofosfáty (insekticidy, nervové bojové látky)  ireversibilní inhibitory acetylcholinesterasy  tvoří kovalentní komplex s hydroxyskupinou serinu • -SH skupiny cysteinu mohou být modifikovány alkylací E-SH + ICH2COO-E-S-CH2COO- + HI

30. Ireversibilní inhibitory

31. Ireversibilní inhibitory • Tyto inhibitory jsou využívány pro studium aktivních center enzymů (díky kovalentní vazbě je možno v hydrolyzátu detegovat příslušnou aminokyselinu)

32. Studium aktivního místa chymotrypsinu Modifikace chymotrypsinu DIFP (diisopropylfluorfosfát) • Modifikován pouze Ser 195 • Ostatní serinové zbytky nejsou modifikovány • Ser 195 se nachází v aktivním místě Proč je modifikován pouze Ser 195? • Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám v aktivním centru

33. Studium aktivního místa chymotrypsinu Modifikace chymotrypsinu TPCK (N-tosylamido-L-phenylethylchloromethylketon) • Modifikován pouze His 57 • Ostatní histidinové zbytky nejsou modifikovány • TPCK napodobuje substrát Proč je modifikován pouze His 57? • Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám v aktivním centru • His 57 je v aktivním místě enzymu • His 57 a Ser 195 jsou blízko sebe

34. Inhibice substrátem • Vysoká koncentrace substrátu • Pokud molekula substrátu musí být vázána v aktivním centru vícebodovým záchytem  konkurence molekul substrátu o vazebná místa  nedokonalá orientace substrátu v aktivním centru • Může způsobovat problémy při stanovení enzymové aktivity nebo při praktickém využití enzymů (enzymové technologie, biotechnologie)

35. Inhibice produktem • Mechanismus zpětné vazby • Zabrání se hromadění produktu

36. Aspartate transcarbamylase

37. Feedback Inhibition

38. Aktivace enzymů • Aktivátory pozitivně ovlivňují rychlost enzymové reakce • Váží se na molekulu enzymu vratně Typické příklady: • Ca2+ (mnohé enzymy; pozor na používání fosfátových pufrů!), stabilizace proteinové struktury • EDTA (odstranění inhibujících kovových iontů) • -SH sloučeniny (např. merkaptoethanol) – reaktivace thiolových skupin cysteinu • Chloridové ionty – aktivace živočišných α-amylas

39. Laboratoře z Enzymologie • 2 dny (za sebou) v průběhu měsíce ledna Přednášky z Enzymologie www.usbe.cas.cz/people/safarik