1 / 32

Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením

Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením. D.Vokurková 1 , J.Vávrová 2 , M.Řezáčová 3 , S.Filip 4 , J.Šinkora 5 1 Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze

trygg
Download Presentation

Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková1, J.Vávrová2, M.Řezáčová3, S.Filip4, J.Šinkora5 1 Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 2 Katedra radiobiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové 3 Ústav lékařské biochemie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 4 Klinika onkologie a radioterapie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta UK, Hradec Králové 5 DakoCytomation AG,Brno

  2. Cíl práce Prozkoumat mechanismy buněčné smrti u hematopoetických buněk za využití flow-cytometrických metod Zavést flow-cytometrické metody ke stanovení apoptózy u hematopoetických buněk, které by mohly být využity k diagnostice obdržené dávky u osob ozářených při radiačních nehodách

  3. Zánik buňky po ozáření Poškození DNA úplný zlom dvojvlákna Jednoduché zlomy (SSB) potenciálně letální poškození DSB subletální poškození Reparace je možná mutace ! reparace Komplexní DSB Reparace velmi nesnadná APOPTÓZA Frakcionace dávky Ozáření s nízkým dávkovým příkonem

  4. Buněčná smrt NEKRÓZA APOPTÓZA Zvětšení buněk Desorganizace Lýza (Programovaná buněčná smrt) Kondenzace cytoplazmy Zmenšení buněk Fragmentace DNA Apoptická tělíska Lymfocyty Hematopoetickékmenové buňky

  5. Metody stanovení apoptózy • Morfologická detekce apoptózy na cytospinových preparátech barvených Giemza-Romanovski • Identifikace podle kondenzace a fragmentace jader a protruzí buněčného povrchu • Stanovení velikosti a granularity buněk (side a forward scater) • Analýza přítomnosti fosfatidylserinu (PS) na povrchu buněk • použitímAPOPTESTU TM-FITC (DAKO)pro dvojí značeníAnnexin V-FITC (vazba k PS) a propidium jodid (detekujícíjadernou DNA) • Stanovení mitochondriálního antigenu APO 2.7bez a s permeabilizací • Flow-cytometrická analýza buněčného cyklu a stanovení sub-diploidního obsahu DNA (sub-G1 buňky)

  6. Indukce apoptózy • Lidská promyelocytární leukémie - HL-60 • Lidská T-lymfocytární leukémie - MOLT-4 • Hematopoetické kmenové buňky • Lymfocyty z periferní krve zdravých dárců • Lymfocyty z periferní krve pacientů s maligním onemocněním po ozařování

  7. LIDSKÁ PROMYELOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE HL-60 D0 = 2, 2 Gy Rychlá interfázová smrt časná apoptóza Dávky nad 10 Gy Buňky umírají z fáze cyklu kde byly ozářeny Mitotická smrt oddálená apoptóza Zástava buněčného cyklu v S fázi a G2 fázi Reparace poškození Ozařování v G2 fázi zvyšuje radiorezistenci buněk Zkrácení bloku v G2 fázi - radiosenzibilizující efekt

  8. HL-60 – 20 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG1 vrcholu bez reparace Rychlý nástup interfázové apoptózy G1=44% S= 44% G2=12% A=2% A=12% A=87% A=48% G1=47% K 2 4 6 24 Čas po ozáření (h)

  9. K 6 h 24 h 72 h 62% G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% 85% 144 h HL-60 – 6 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG1 vrcholu reparace poškozeníoddálená (postmitotická) apoptóza Oddálená apoptóza

  10. NO 10Gy G 2=73% G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% O 10Gy G 2=10% K 89 h 41 h 65 h 161 h Šetřící efekt ozařování s nízkým dávkovým příkonem na buňky HL-60 (reparace poškození v G2 bloku) Vliv ozáření s vysokým-0,6 Gy /1 minutu (O) a nízkým - 3,9 mGy /1minutu (NO) dávkovým příkonem na průběh buněčného cyklu a indukci apoptózy u buněk HL-60 ozářených dávkou 10 Gy. Čas představuje dobu od začátku ozařování .Skupina ozařovaná nízkým dávkovým příkonem byla ozařována 41 hodin. Z obrázku je patrno, že v konci dlouhodobého ozáření dávkou 10 Gy jsou všechny buňky v G2 fázi a reparují radiační poškození. Dávka není absolutně letální jako je to v případě jednorázového ozáření s vysokým dávkovým příkonem. 161 h po začátku ozařování jsou již přítomny prakticky všechny živé buňky

  11. LIDSKÁ T- LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE MOLT-4 D0=0,8 Gy velká radiosenzitivita p53 wild typ relativně rychlá indukce apoptózy bez dlouhého bloku v G2 fázi

  12. MOLT-4 – 3 Gy - Flow cytometrické stanovení obsahu DNA a buněčného cyklu 24 hodin po ozáření A= 3% G1= 29 % S= 49% G2= 19% K 6 h A= 1% G1= 57 % S= 37% G2= 5% 16 h 24 h A= 24 % G1= 11 % S= 53 % G2= 12 % A= 35% G1= 11 % S= 52% G2= 2% Apoptotickébuňky

  13. Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí APO2.7) za 16 hodin po ozáření 16 hodin po ozáření buněk MOLT-4 vykazuje nárůst APO2.7 pozitivity lineárnídávkovou závislostv rozmezí dávek0.2-5 Gy.

  14. Časová závislost indukce apoptózy po dávce 1 Gy K 1. 3. 6. 14. den FSxSS A/CD7 % A+ 11 36 47 24 12

  15. Buňky MOLT-4 jsou citlivější k indukci apoptózy vyvolané ionizujícím zářením Malý blok v S a G2 fázi (malá reparace poškození) Význam proteinu p53 pro indukci apoptózy Buňky HL-60 jsou radiorezistentnější Bez p53 Dlouhý blok v G2 fázi, reparace poškození Ozařování s nízkým dávkovým příkonem má šetřící efekt, stoupá radiorezistence (D0), reparace poškození v G2 bloku probíhá již v průběhu ozařování Závěr – leukemické linie

  16. 85% KMENOVÉ BUŇKY KRVETVORBY • vliv ionizujícího záření na kmenové buňky krvetvorby izolované z periferní krve zdravých dárců po mobilizaci G-CSF - izolovány na separátoru • PKB obsahovaly 0,5-1% CD133+ buněk, dále izolovány imunomagnetickou selekcí pomocí imunomagnetických partikulí izolující CD133 pozitivní buňky

  17. Expanze CD133+ buněk (SCF, IL-3,FLT3-L) ex vivo • Buňky izolované imunomagnetickou separací jsou prakticky všechny v G0 fázi buněčného cyklu. Za 168 h po začátku expanze je 35% buněk v S fázi

  18. S=35% Průběh buněčného cyklu a indukce apoptózy u buněk CD133+ ozářených in vitro 2,5 Gy a expandovaných ex vivo v přítomnosti cytokinů IL-3 + SCF + FLT3-L • 24h po ozáření je 60% buněk apoptických, maximum apoptózy bylo 72 h po ozáření (80%)

  19. LIDSKÉ LYMFOCYTY Izolace z periferní krve In vitro ozáření Stanovení apoptózy (Annexin V) Změny počtu NK buněk

  20. Buněčné změny v procesu apoptózy vedou ke ztrátě asymetrie membránových fosfolipidů během časné fáze apoptózy U živých buněk je phosphatidylserin (PS) na vnitřní straně buněčné membrány Během apoptózy je PS transportován na vnější stranu buněčné membrány a je přístupný pro vazbu annexinuV v přítomnosti Ca2+ iontů Metoda umožňuje současné stanovení povrchových znaků lymfocytů spolu s annexinem V Metoda stanovení anexinu V - indukce časné fáze apoptózy

  21. Dynamika indukce apoptózy lidských lymfocytů (CD45+/CD14-) po in vitro ozáření dávkou 7 Gy Anexin V pozitivita A+ A+/PI+ Anexin Va propidium jodid pozitivita

  22. Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí Annexinu V) za 16 hodin po ozáření ANNEXIN V – INDIKÁTOR DÁVKY ?

  23. Dávkově závislá indukce apoptózy lymfocytárních subpopulací ozářených dávkou 5Gy

  24. NK buňky • součást vrozené imunity • asi 15% ze všech cirkulujících lymfocytů • schopnost lyzovat cílové buňky • časný zdroj imunoregulačních cytokinů • podle density povrchového markeru CD56 – 2 odlišné populace • 90% - nízkodensitní exprese receptoru CD56 (CD56dim) a zároveň exprese vysokoafinitního (FcgRIII,CD16) – CD56dim/CD16 • hlavně cytotoxická aktivita • 10% NK – CD56bright/CD16dim, CD56briht/CD16- • produkceimunoregulačních cytokinů (IFNg) • nízká přirozená cytotoxicita

  25. CD56dim CD56bright Subpopulace CD3-/CD8+/CD56dim CD3-/CD8+/CD56bright

  26. INDUKCE APOPTÓZY U LYMFOCYTŮ PO OZÁŘENÍ IN VIVO • pacientka J. ozařována pro karcinom cervix uteri na lineárním urychlovači fotony s energií 6 MV • ozařovaná na oblast břicha frakcionovaně do celkové dávky 38 Gy (2 Gy/frakci) • původně plánovaná dávka 44 Gy • vzhledem ke zdravotním komplikacím pacientky redukována na 38 Gy • na obrázku znázorněno ozařovací pole

  27. Změny počtu NK buněk v závislosti na čase u pacientky J. sloupečky představují vždy dávku záření 2 Gy

  28. Vzestup počtu A+ NK buněk po frakcionovaném ozáření pacientky J. 1 hodinu po ozáření (tmavě fialová křivka) a po 24 h in vitro inkubaci v termostatu (světle fialová křivka) parciální ozáření 2 Gy vede k mírnému (nesignifikantnímu) vzestupu Annexin+ NK buněk především po 24 h inkubaci in vitro

  29. Pokles relativního zastoupení NK buněk (CD3-/CD8+) a jejich subpopulací CD56dim a CD56bright po in vivo celotělovém ozářenípacientky dávkou 2 Gy. celotělová dávka 2 Gy vede k poklesu počtu NK buněk za 24 a především za 48 h po ozáření. Populace CD56brightse zdá být citlivější než populace CD56dim

  30. Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy. Dávka 2 Gy na relativné malou oblast břicha vede k vzestupu počtu apoptických NK buněk. U lymfocytů i T lymfocytů je vzestup po ozáření nevýrazný. Odpověd na ozáření je velmi nehomogenní.

  31. Výrazný vzestup Srovnání % zastoupení A+ NK buněk u zdravých dárců a pacientů s nádory – před terapií Nejvyšší vzestup indukce apoptózy u NK buněk pacientůs nádory ve srovnání se zdravými dárci krve. Vzestup apoptózy u lymfocytů i T lymfocytů byl méně patrný.

  32. Závěr • Dvoubarevná imunofenotypizace kombinovaná s analýzou navázaného Annexinu je dostatečná pro biodozimetrii v in vitro kultivovaných lymfocytech. • Studium NK buněk při ozáření in vivo pacientů s nádory je komplikováno faktem, že NK buňky reagují zvýšenou apoptózou na přítomnost nádorových buněk a procento apoptických buněk je již před ozářením významně vyšší než u zdravých dárců. • V případě ozáření pacientek s karcinomy endometria a čípku děložního technikou box (relativně malý objem oblasti břicha) došlo při 24 h inkubaci k relativně malému poklesu počtu NK buněk. • Po celotělovém ozáření pacientky s hematologickou malignitou (2 Gy) jsme prokázali výrazný pokles NK buněk především 48 h po ozáření, což je v souladu s experimenty in vitro. • Je tedy zřejmé, že doba inkubace po ozáření má zásadní význam pro průkaz poklesu NK buněk po malých dávkách záření. Práce vznikla za podpory grantu 202/04/0598 GAČR a MO ČR Záření II

More Related