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基因表达沉默技术

基因表达沉默技术. 中南大学肿瘤研究所 杨力芳 2012-5-21. 后基因组研究焦点：基因功能研究. Antisense. Ribozyme/DNAzyme. Knock Out. RNAi. 抑制基因表达. 观察功能变化. ◆ 反义核酸 (Antisense ). ◆ 核酶与脱氧核酶 (Ribozyme and deoxyribozyme). ◆ 小干扰 RNA (Small interfering RNA). 从 mRNA 水平关闭靶基因的方法. 一、反义核酸 1. 概念（ concept)

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基因表达沉默技术

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  1. 基因表达沉默技术 中南大学肿瘤研究所 杨力芳 2012-5-21

  2. 后基因组研究焦点：基因功能研究 Antisense Ribozyme/DNAzyme Knock Out RNAi 抑制基因表达 观察功能变化

  3. ◆反义核酸(Antisense ) ◆核酶与脱氧核酶(Ribozyme and deoxyribozyme) ◆小干扰RNA (Small interfering RNA) 从mRNA水平关闭靶基因的方法

  4. 一、反义核酸 1. 概念（concept) 反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。 2. 分类(classification) ◆反义DNA:与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子(反义寡脱氧核糖核苷酸 antisenceoligodeoxynucleotide , ODN) ◆反义RNA:与mRNA完全互补的一段小分子RNA

  5. 3. ODN (1) 特点 ●易被体内外核酸酶破坏而失去活性 ●通过化学修饰􀂾 抵抗核酸酶的裂解增强其稳定性􀂾 以维持充分的细胞内浓度􀂾 较长的细胞内半衰期􀂾 自然反义ODN的不易透过细胞膜而达到作用靶位，通过修饰的反义ODN 可以增加透膜性 ●反义DNA分子除了化学合成以外，别无其他来源，不能采取基因工程技术生产，或体内表达的基因治疗技术。但反义DNA分子比反义RNA分子较容易得到，也较稳定。

  6. (2)、反义寡核苷酸的作用机制 Mechanism of antisense oligonucleotide ●抑制mRNA的翻译 Inhibit mRNA translation 􀂉 ●抑制复制或转录 Inhibit replication or transcription 􀂉 ●抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达 Inhibition of protein processing、modification and expression 在DNA结合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基因结合形成三螺旋DNA，并且位点专一性地干扰DNA和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制

  7. (3)、反义寡核苷酸的设计与合成 Design and synthesis of ODN ①设计(Design) ●计算机软件预测RNA的二级结构 ●利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计 ②合成(synthesis) ●长度： 15～25个核苷酸 ●G-C 含量: 60%～65%

  8. 4. 反义RNA （antisence RNA) (1)、反义RNA的作用机制 Mechanism of antsenceRNA Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解； Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译； Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录

  9. (2)、反义RNA的设计和合成 Design of antisenceRNA ●化学合成反义RNA分子􀂾 ●重组DNA技术设计和制备出反义RNA, 将编码特异性反义RNA所对应的DNA的片段重组到真核表达载体中，再将这种重组的反义RNA表达载体导入到细胞里，可明显观察到反义RNA的表达，抑制靶基因的活性。

  10. 5.反义寡核苷酸的应用 • ● 抗肿瘤 • ● 抗病毒 • 第一种ASODN药物---Vitravene • 98年，第一种ASODN药物由FDA批准使用 • 用于治疗一种由CMV（巨细胞病毒）引起的眼部传染病---巨细胞病毒性视网膜炎 • 流行于艾滋病人中

  11. 二、核酶与脱氧核酶 Ribozymeand deoxyribozyme （一）. 核酶(Ribozyme) 概念（concept) 具有自我剪切和催化功能的RNA分子，其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达

  12. 1981年美国科学家Cech等人阐明了四膜虫35sRNA前体的拼接机制,并证明了L-19分子具有poly C聚合酶活性。 1983年Altman发现RNA本身即可催化rRNA前体成熟，由此大家开始认识到某些RNA也具有酶的功能，突破了蛋白质酶类的传统生物催化剂的概念。这些能够催化RNA剪接的由RNA组成的酶被称作“核酶”(ribozyme,Rz)。 Cech与Altman分享了1989年的诺贝尔化学奖 Thomas Cech Sidney Altman

  13. 1、核酶的分类(Classification) 大分子核酶： 第Ⅰ类内含子 group I intronribozyme􀂾 第Ⅱ类内含子 group II intronribozyme􀂾 核糖核酸酶P RNAseP 小分子核酶：􀂾 锤头状RNA Hammerhead ribozyme􀂾 发夹形RNA Hairpin ribozyme􀂾 肝炎D病毒RNA hepatitis delta ribozyme Neurospora Varkud satellite核酶 Neurospora VS ribozyme

  14. 锤头核酶 自体催化 发夹核酶 剪切型核酶 剪接型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化 根据催化反应 I型内含子 II型内含子

  15. 2.核酶的结构和作用 (1) 自我剪接 ribozyme • 自我剪接ribozyme比较复杂，通常包括200个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。 • 四膜虫核糖体前体RNA可以在体外无蛋白质参与下除掉它自身413nt内含子。 • 具有核酸内切酶和连接酶活性。(既剪又接)

  16. Ⅰ型和Ⅱ型内含子 Ⅰ型和Ⅱ型内含子的二级结构 这两种类型的内含子的二级结构比较特别，有很多柄环结构，反映出它们的序列中存在反向重复序列。

  17. Ⅰ类内含子的自我剪接 图中的pG可以是GTP、GDP或是GMP

  18. Ⅱ类内含子的自我剪接

  19. (2). 自我剪切ribozyme • 自我剪切ribozyme是只剪不接,能够催化自身RNA或不同的RNA分子,切下特异的核苷酸序列. • 自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指向自我剪切的部位。 • 相当于核酸内切酶

  20. RNAse P(异体催化剪切型) ● 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物。 ●RNAse P是第一个被发现的蛋白质以外具有催化活性的生物大分子,它参与加工tRNA的初始转录产物, 能剪切所有tRNA前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’-磷酸末端。 ● 不同tRNA的 5’ 端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列， RNaseP所识别的是底物的高级结构。 RNAse P的结构

  21. 锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图 • 三个双螺旋区。 • 13个核苷酸残基保守序列。 • 剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生。 锤头形核酶存在于多种植物RNA病毒的卫星病毒中，它具有高度专一的核酸内切酶活性，能够催化自身发生RNA剪切反应，是核酶中应用最广泛、研究最深入的一类，被认为是了解RNA催化机制的模式核酶。

  22. 单金属离子催化 双金属离子催化 锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化过程需要二价金属离子参与。

  23. 发夹型核酶二级结构模型 • 四个螺旋区、三个连接区和两个环。 • 剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端。

  24. 切剪部位 剪切部位 丁型肝炎病毒（HDV)核酶结构模式 三个碱基对的茎 需要二价阳离子， 产生5‘-OH和 2’,3’-环磷酸

  25. 剪切型核酶剪切机制 转酯化过程： 由靠近切割位点3‘端的2’OH或氧原子对切割位点的磷原子实施亲核攻击，产生5‘-OH 和2’，3‘-环磷酸二酯。 核酶自身剪切反应

  26. 3、影响核酶活性的因素 1、pH值对活性的影响： pH7.0- 7.5时核酶活性最高。 2、二价金属阳离子对活性的影响: Mg2+ Mn2+ 3、抗生素对活性的影响： 大多数为抑制效应 4、变性剂对活性的影响: 5、温度对活性的影响: 在65℃范围内随温度升高而增加，37 ℃时均有适宜的活性。 4.核酶作用的特点 ● 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。 ● 免疫源性低，很少引起免疫反应。 ● 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。

  27. 5.核酶在医学上的应用 1、核酶抗肝炎病毒的研究 已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。 2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV- Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。 3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。

  28. Angiozyme和Heptazyme

  29. 6、核酶技术面临的问题 1、核酶催化切割反应的可逆性问题 2、提高催化效率 3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 4、使核酶在细胞内有调控地高效表达 5、增强核酶在细胞内的稳定性 6、对宿主的损伤问题有待进一步考察

  30. （二）脱氧核酶 deoxyribozyme ● 体外选择技术筛选脱氧核酶 脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。 ●脱氧核酶催化特征 1. 10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 2. 双链稳定性越高，酶活性越高 3. 结合臂的长度影响酶催化转换性：RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。 4. 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 5. 组氨酸，精氨酸促进催化活性 6. 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）

  31. 1、脱氧核酶的种类 （1）10-23型脱氧核酶： （2）8-17型脱氧核酶：

  32. 2、脱氧核酶的作用机理 10-23型脱氧核酶作用机理 deoxyribozyme R Y R 5 3 R=A or G Y=C or U RNA substrate 切割点

  33. 8-17型(发卡型)脱氧核酶自我剪切作用机理 切割点 10 5‘ 20 3‘ C A 3‘ 茎I(结合部位) 40 30 茎II (催化部位)

  34. 脱氧核酶与核酶的比较

  35. 3、脱氧核酶的应用 • 疾病的基因治疗：恶性肿瘤，病毒感染性疾病等 • 基因功能研究 • 其它应用 ：组织标本中基因突变的分析 ，对RNA二级结构进行鉴别 ，脱氧核酶荧光定量PCR

  36. Prediction of LMP1 mRNA secondary structure (mfold version 3.1. Folds of LMP1 at 37℃ ) 以EBV-LMP1为靶点,筛出3条有效靶向LMP1的脱氧核酶DZ1、DZ7和DZ10,发现其明显抑制NPC细胞增殖,诱导细胞凋亡。

  37. A B MTT PCR/Western Blot Inhibition of LMP1 protein expression in CNE1-LMP1 cells by DNAzymes and the effect on the cell proliferation. Yang LF, et al. Molecules, 2010, 15(9): 6127-6139.

  38. DZ1 could interfering signal pathways which are abnormally activated by LMP1, including NF-B, AP-1, STAT3 and other important signal pathways Effect of DNAzymes on cellular NF-κB , AP-1 and STAT3 signal transduction pathway in CNE1-LMP1 cells. (A) NF-κB pathway; (B) c-jun/JNK pathway; (C) Stat3 pathway. Yang LF, et al. Molecules, 2010, 15(9): 6127-6139.

  39. The DNAzyme could inhibit its target gene LMP1 expression in tumors, which led to a significant suppression of tumor growth of NPC in vivo, and the data showed that the DZ1 could enhance radiosensitivity. Tumor growth curve of DZ1 inhibited tumor growth and enhance radiosensitivity in vivo. Six mice per group were injected DZ1 intratumorally twice weekly and irradiation treatments were performed at 5Gy. Yang LF, et al. Molecules, 2010, 15(9): 6127-6139.

  40. 三 RNAi（RNA interfering) 概念（concept) 与靶基因序列同源的双链RNA （double stranded RNA，dsRNA） 所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。 ● 一种古老、保守而又及其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监控和防御,有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。 ● 一种抗病毒感染机制。

  41. Timeline for RNAi Dicsoveries Nature Biotechnology21, 1441 - 1446 (2003)

  42. A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + dsRNA Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization

  43. siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA， siRNA每条单链的3’端都带有2个突出的非配对碱基（多数是UU）􀂄消耗能量； • RISC（RNA-induced silencing complex）形成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP； • RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式； • 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA，在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA,无需或消耗少量ATP。 2. siRNA与RNAi

  44. RNA干扰的分子机器 • (1). Dicer: RNase III类似的，包含多个功能结构域的核糖核酸酶，将dsRNA切割成小的short interfering RNAs (siRNAs) ，并将这些产物加载到RISC上 • 序列的结构组成: • 1. 一个PAZ结构域，与 dsRNA的末端结合 • 2. 两个RNase III结构 • 3. 其他的功能结构域

  45. AGO2 TRBP Dicer • (2). RISC (RNA induced silencing complexes) (RNA诱导的沉默复合体):包含多个蛋白质的复合物，将与之连接的siRNA或miRNA定位到其靶点并抑制靶基因的表达

  46. RNAi至少有三种机制： 1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级”短RNA（siRNA）。 2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。 3、短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代“次级siRNAs“（靶序列直接扩增），并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。

  47. 优点(advantage)： 1、特异性好 Specific good 2、抑制效率高 High-efficiency suppression 3、操作相对简单，实验周期短 Relatively simple operation 缺点(disadvantage) ： 1、靶点选择的不确定性 The choice of target uncertainty 2、核酸的不稳定性 The nucleic acid instability 3、脱靶效应Off-target effects 4、生物安全性Biological Safety（质粒，病毒等）。

  48. 3. 一般研究路线

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