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Molecular biology for ecologists

Molecular biology for ecologists. DNA. DNA :细胞核、线粒体、叶绿体. nrDNA mtDNA cpDNA. 核酸. RNA :细胞质. nrDNA. 核酸. 核苷酸. 磷酸. 核苷. 戊糖. 碱基. C. T. nrDNA. nrDNA. T. C. A. G. Q :对于 GC 含量高的 DNA 模板,在 PCR 过程中,需要注意什么?. nrDNA. DNA 的一级结构. 4 种核苷酸的连接及其排列顺序 表示了 DNA 分子的化学构成. nrDNA. DNA 的二级结构.

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Presentation Transcript


  1. Molecular biology for ecologists

  2. DNA DNA:细胞核、线粒体、叶绿体 nrDNA mtDNA cpDNA 核酸 RNA:细胞质

  3. nrDNA 核酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 碱基

  4. C T nrDNA

  5. nrDNA T C A G Q:对于GC含量高的DNA模板,在PCR过程中,需要注意什么?

  6. nrDNA DNA的一级结构 4种核苷酸的连接及其排列顺序 表示了DNA分子的化学构成

  7. nrDNA DNA的二级结构 2条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构

  8. nrDNA DNA的二级结构

  9. nrDNA DNA的三级结构 DNA分子通过扭曲和折叠形成的特定构象

  10. nrDNA DNA的四级结构 DNA与蛋白质复合物的结构

  11. nrDNA Q:电泳检测PCR产物分子量大小时,为什么要先进行PCR产物的变性?

  12. DNA的性质 • 水解性:糖苷键,磷酸二酯键 • 酸碱性:磷酸基,碱基 • 紫外吸收:碱基 • 变性与复性:双螺旋结构

  13. 水解 • 酸解性 • 对酸最不稳定的是嘌呤和脱氧核糖之间的糖苷键 • 碱水解 • DNA无2’-OH,不能形成碱水解的中间产物,对碱有一定抗性 • 酶水解

  14. 水解 • 酶解性 • 磷酸二酯酶:非特异性水解 • 核酸酶:专一水解 • 核酸内切酶 • 核酸外切酶

  15. 限制性内切酶 1. 具有较高的专一性。能识别DNA分子中上特有的碱基顺序,并在特有的位点上切割。其识别顺序大多具有回文结构,回文结构也称反向重复序列。

  16. 限制性内切酶 1. 具有较高的专一性。能识别DNA分子中上特有的碱基顺序,并在特有的位点上切割。其识别顺序大多具有回文结构,回文结构也称反向重复序列。 2. 大多数限制性内切酶对两条DNA链进行交错切割,所以切割后形成末端为单链的互补顺序,即粘性末端。

  17. 限制性内切酶

  18. 限制性内切酶的命名 EcoRI 材料属名的第一个字母 该材料中已分离出的该类酶的编号 材料种名的头两个字母 所用菌株

  19. 限制性外切酶

  20. DNA的性质 • 水解性:糖苷键,磷酸二酯键 • 酸碱性:磷酸基,碱基 • 紫外吸收:碱基 • 变性与复性:双螺旋结构

  21. DNA的酸碱性 当pH > pI时, =N+H-上的H+解离下来 核苷酸带负电 凝胶电泳分离核酸

  22. DNA的凝胶电泳 • 迁移率 • 分子大小 与分子量对数成反比 • 胶浓度 与胶浓度成反比 • DNA构象 超螺旋 > 线性 > 开环 • 电流 与电流大小成正比5V/cm • 碱基组成 影响不大

  23. 紫外吸收性质 核酸的最大吸收值在260nm附近

  24. 蛋白质的最大吸收值在280nm附近

  25. DNA纯度的检测 = 2.0 纯RNA 1.8 - 2.0 DNA纯度高 A260/A280 < 1.8 有蛋白

  26. DNA浓度的检测 A260 = 1 等价于 50 μg/mL 双螺旋DNA 40 μg/mL 单链DNA或RNA

  27. DNA的性质 • 水解性:糖苷键,磷酸二酯键 • 酸碱性:磷酸基,碱基 • 紫外吸收:碱基 • 变性与复性:双螺旋结构

  28. DNA的变性与复性 DNA变性: 指双螺旋区的氢键断裂,形成单链无规则线团的过程。

  29. DNA的热变性 DNA热变性 爆发式 发生在很窄的温度范围内

  30. DNA的热变性 DNA的熔点 Tm 加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温度 82 - 95℃

  31. Tm与GC含量

  32. Tm与介质离子强度 ∝ Tm 介质离子强度 DNA制品不应保存在极稀的电解质溶液之中,在含盐缓冲液中保存较为稳定

  33. DNA的复性

  34. DNA的复性 • 变性DNA • 缓慢冷却,DNA复性 • 退火 • 2. 骤然冷却,不能复性 • DNA电泳前的变性 核酸杂交:Southern杂交

  35. DNA的复制

  36. 转录 翻译 复制 DNA mRNA 蛋白质 反转录 翻译 蛋白质 (病毒) 复制 RNA (病毒) 中心法则

  37. DNA的复制: 以亲代DNA为模板,根据碱基配对的原则,在一系列酶的作用下,生成与亲代相同的子代DNA的过程。

  38. DNA的半保留复制 模板:亲代DNA双链 碱基互补 新形成的子代DNA中,一条链来自亲代DNA,另一条链是新合成的 DNA的复制需要模板的指导!

  39. DNA的半不连续复制 以5’ →3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段,再连接成滞后链。

  40. DNA的半不连续复制 DNA复制需要引物启动

  41. DNA链的延伸 DNA聚合酶Ш催化 底物:四种5’-脱氧核苷三磷酸 在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。

  42. DNA链的延伸 DNA链的延伸 冈崎片段怎么连接? DNA连接酶 RNA引物怎么办? 5’ 3’核酸外切酶 碱基错配怎么办? 3’ 5’核酸外切酶

  43. DNA复制体系 模板:母链DNA 引物:一小段RNA 原料:dNTP 酶和蛋白质因子:DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA外切酶

  44. DNA复制对分子生态学研究的意义 • 引物 可以根据研究需要设计相应的引物 扩增特定的片段 • 游离的3’-OH 当3’-OH脱氧时,DNA链不能延伸 双脱氧测序法

  45. PCR Polymerase chain reaction Mullis 1993 诺贝尔化学奖

  46. 模板

  47. 模板

  48. dNTP,引物,Taq聚合酶

  49. dNTP ATP

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