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Molekularbiologische Arbeitstechniken

Molekularbiologische Arbeitstechniken. Ergebnisbericht A von Kim Ortmeier. Gliederung. Vorstellung der Experimente Ziel der Experimente Theorie Gesamtergebnisse des Kurses Diskussion

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Molekularbiologische Arbeitstechniken

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Presentation Transcript

  1. Molekularbiologische Arbeitstechniken Ergebnisbericht A von Kim Ortmeier

  2. Gliederung Vorstellung der Experimente • Ziel der Experimente • Theorie • Gesamtergebnisse des Kurses • Diskussion Alle Versuche werden nach den Anweisungen im Skript durchgeführt, Abweichungen werden im Folgenden beschrieben.

  3. Expression und Reinigung Aus den Bakterien werden die Proteine extrahiert und aufgereiniget: • Durch Quarzsand werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen • Durch kochen denaturieren die Proteine • Waschen und eluieren

  4. Expression und ReinigungVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: Aufschluss • 100 ml Kultur פּ, • Pellet waschen (mit 100 ml Waschpuffer), פּ • Pellet in 3 ml Aufschlusspuffer resuspendieren • Aufschlußpuffer enthielt bei den Gruppen 4-6 zusätzlich noch 5mM Imidazol • In Ribotube überführen פּ (3x 30 sec; 6,5 ms; da zwischen jeweils 1 min auf Eis) • 45 min, 4°C, 14000 rpm פּ, Überstand in Eppi

  5. Expression und ReinigungVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: • B) Wasch I: 5 mM => 0,2 ml • C) Wasch II: 10 mM => 0,4 ml • D) Eluat III: 50 mM => 2 ml • E) Eluat IV: 150 mM => 6 ml • F) Eluat V: 250 mM => 10 ml Auf je 10 ml mit Aufschlußpuffer auffüllen

  6. Expression und ReinigungVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: • Es werden verschiedene Mengen an Protein auf die Säule gegeben Gruppe 1 + 4 -> 4 mg Protein Gruppe 2 + 5 -> 6 mg Protein Gruppe 3 + 6 -> 8 mg Protein

  7. Bradford- Test • Colorimetrische Methode zur Quantifizierung von Proteinen • Coomassie Brillant Blue bindet an Proteine • Menge des Farbstoffes wird im Photometer bei OD595 gemessen • Konzentration wird mit Formel berechnet: c = (MeßwertOD595 x Verdünnung x 16,2)/ Meßvolumen [µg/µl]

  8. Bradford- TestVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: • Verdünnungsreihe der Kultur: • 1:40 -> 25 µl Kultur + 975 µl Waschpuffer • 1:50 -> 20 µl der 1:40 Verd. + 980 µl Waschpuffer (1:200 Verdünnung) • Je 2x 200 µl BioRAD + 800 µl der 1:50 (1:2000) Verdünnung

  9. Bradford- TestGruppenergebnisse • Es wurden je 2 Proben gemessen -> Mittelwertbildung = Messwert • Mittelwert des Proteingehaltes aller Gruppen = 8,547 µg/µl

  10. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese • Gelelektrophorese von Proteinen -> ausschließlich Polyacrylamid als Träger • Separierung der einzelnen Substanzen hängt ab von: • ihrer unterschiedlichen Ladungen • Porengröße des Gels • Größe/ Gestalt der Moleküle • pH- Wert, Temperatur, Ionenstärke des Puffers • Elektrische Feldstärke • Diskontinuierliches Verfahren

  11. SDS- PolyacrylamidgelelektrophoreseVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: • Zusammensetzung für 1 Trenngel (12,5 %): 1,88 Tris pH 8,8 -> 1,2 ml 0,5 % SDS -> 1,2 ml H2O -> 1,1 ml Bisacrylamid -> 2,5 ml TEMED -> 5 µl APS -> 30 µl

  12. SDS- PolyacrylamidgelelektrophoreseVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: • Zusammensetzung für 1 Sammelgel (5 %): 0,625 Tris/ HCl pH 6,8 -> 0,4 ml 0,5 % SDS -> 0,4 ml H2O -> 0,87 ml Bisacrylamid -> 0,33 ml TEMED -> 2 µl APS -> 10 µl

  13. SDS- PolyacrylamidgelelektrophoreseVersuchsdurchführung Abweichungen vom Skript: • Zusammen führen der Fraktionen mit Puffer: • Roh-Protein: 8 µg/µl + 3 µl Puffer • Bindung • Wasch I + II • Eluat III – V • Ca. 5 min Kochen der Proben bei 100°C • Abkühlen, zentrifugieren und beladen der Taschen im Gel mit den Proben je 12 µl + 3 µl Puffer

  14. Coomassie- Blue- Färbungdes Gels • Proteinbanden im Gel werden durch Coomassie- Blue sichtbar gemacht • Coomassie- Blue in sauer Umgebung als Anion mit den Aminogruppen der Proteine

  15. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue FärbungGruppenergebnisse Vergleich der Gele der 1.+ 2. Gruppe M R B W1 W2 E3 E4 E5 R M B W1 W2 E3 E4 E5 M= Marker, R= Rohextrakt, B= Bindung, W1+2= Wasch 1 +2, E 3-5= Eluat 3-5

  16. Vergleich der Gele der 3.+ 4. Gruppe SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue FärbungGruppenergebnisse R B M W1 W2 E3 E4 E5 R B W1 M W2 E3 E4 E5 M= Marker, R= Rohextrakt, B= Bindung, W1+2= Wasch 1 +2, E 3-5= Eluat 3-5

  17. Vergleich der Gele der 5.+ 6. Gruppe SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue FärbungGruppenergebnisse R B W1 W2 M E3 E4 E5 R B W1 W2 E3 M E4 E5 M= Marker, R= Rohextrakt, B= Bindung, W1+2= Wasch 1 +2, E 3-5= Eluat 3-5

  18. 1., 2. und 3. Gruppe M M M M M M 4., 5. und 6. Gruppe M= Marker

  19. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue FärbungDiskussion Es ist gut sichtbar, dass die Reinigung relativ gut geklappt hat und dass metY in einer Bande in der Reihe E5 konzentriert vorliegt. Man kann aber keine deutlichen Unterschiede zwischen den Gelen mit verschieden aufgetragenen Proteinmengen erkennen. Unterschiede wären vielleicht zu erkennen gewesen, wenn nicht die gleichen Volumina, sondern die gleichen Molekulargewichte aufgetragen worden wären.

  20. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue FärbungDiskussion Außerdem lässt sich keine starke Verbesserung in Bezug auf die Reinheit der Eluatreihen, durch die Zugabe von 5 mM Imidiazol (Gruppen 4-6) feststellen. Eine größere Menge an Imidiazol würde vielleicht einen Unterschied erkennen lassen.

  21. Danke, das war´s!

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