Unisessualità e deriva molecolare: diversità della sequenza Bag320 in Bacillus

1. Unisessualità e deriva molecolare: diversità della sequenza Bag320 in Bacillus Chiara Barbieri

2. Il DNA satellite • componente principale del corredo genetico non sintetizzante • C-value paradox • coinvolto in molti processi e funzioni • struttura e dinamica dei centromeri • evoluzione del cariotipo • transcriptasi sesso/tessuto-specifica

3. Evoluzione Concertata • Omogeneizzazione delle nuove varianti con meccanismi di turnover genomico • Fissazione per redistribuzione dei cromosomi in nuove combinazioni con la riproduzione sessuale • opera distintivamente da selezione naturale e deriva genetica • diffondersi di nuove varianti all’interno delle famiglie ripetute • fissazione come conseguenza della ridistribuzione cromosomica in nuove combinazioni

4. Bag320 • DNA satellite che presenta una variabilità tipica del pattern dell’evoluzione concertata. • Il genere Bacillus condivide la stessa famiglia satellitare pericentrometrica Bag320 e mostra una ampia gamma di meccanismi riproduttivi. • La variabilità di Bag320 è stata analizzata in differenti popolazioni di B. grandii, B. atticus, B. whitei, B. lynceorum (906 sequenze analizzate), per esaminare il contributo del meccanismo di turnover genomico e delle differenti strategie riproduttive alla variabilità dei satelliti.

5. Il genere Bacillus • Bisessuali: • B. rossius partenogenetico facoltativo. Mediterraneo ovest. • B. grandii strettamente bisessuale. Endemico area siciliana. • B.grandii grandii popolazioni relitte sud-est • B.grandii benazzii stretta cintura nel nordest e isola di Levanzo • B.grandii maretimi isola di Marettimo, Egadi.

6. Unisessuali: • B.atticus automittico partenogenetico • B. atticus atticus diploide, molto distribuito • B. atticus carius popolazioni triploidi in Grecia e Turchia e una popolazione diploide turca. • B. atticus cyprius diploide, a Cipro • IBRIDI: • 3 ibridi telitochi: • B. whitei (rossius+grandii grandii) apomittico diploide • B. lynceorum (rossius+grandii grandii+atticus) apomittico triploide • B. rossius-grandii, ramo ibridogenetico/androgenetico.

8. MATERIALI E METODI • Campionamento • Raccolti da 3 a 6 esemplari per popolazione • mantenuti in laboratorio in gabbie areate con piante fresche per cibo • corpi congelati e mantenuti a -80° C per conservarli per ricerche allozimatiche e molecolari

9. Caratterizzazione allozimatica degli unisessuali • Analisi elettroforetiche sui campioni di sole femmine che rappresentano diversi biotipi, ricercando enzimi caratterizzati da polimorfismo. • Analisi mitocondriale degli unisessuali • Il gene COII è stato amplificato con PCR da singoli esemplari • Mutazioni puntiformi sono state prese come indicative di differenti aplotipi

10. Analisi del monomero Bag320 • Dal DNA genomico preparato da singoli esemplari. Specifici enzimi di restrizione. • Monomeri di circa 320 bp estratti da gel di agarosio, legati al plasmide vettore, usati per ottenere cellule di E. coli competenti. Cloni ricombinanti identificati con il sistema bianco-blu del gene ßgalattosidasi. • sequenziati direttamente • sequenze allineate con algoritmo Clustal del programma Sequence Navigator • Ottengo 10 sequenze per ogni campione di B.grandii, B. atticus e B. whitei • B. Lynceorum condivide sequenze di origine grandii, atticus e rossius • STATISTICA • Distanza percentuale media valutata con Mega2.1 • Analisi della varianza a una via • Tutti i livelli di confronto: intrafemmine, intrapopolazione, interpopolazione, intersottospecie e interspecie • Le sequenze di Lynceorum sono state analizzate per eventi di conversione genica con DnaSP version 3

11. Risultati • Caratterizzazione genetica degli unisessuali (analisi mitocondriali e allozimatiche) • Le 5 popolazioni di atticus studiate hanno mostrato 2 situazioni opposte. • lo stesso aplotipo mitocondriale ma struttura allozimica composta • stessa struttura genetica allozimatica ma differenti aplotipi mitocondriali • Le popolazioni unisessuali utilizzate per l’analisi satellitare sono decisamente eterogenee da un punto di vista genetico

12. Variabilità Bag320 • Lunghezza media: 314,1 bp (grandii maretimi, atticus) fino 315,7 bp (grandii grandii) • variazioni di lunghezza notevoli da rimozioni random • In B. lynceorum 20 sequenze -grandii e 4 -atticus mostrano tratti convertiti che derivano dall’altro subset. CONFRONTO INTRASPECIFICO • B. grandii • B. grandii grandii e B. grandii benazzi: diversità di sequenze omogenea sia tra che entro gli individui (in particolare B. grandii grandii) • B grandi maretimi ha variabilità maggiore • Il confronto tra le sottospecie mostra valori di variabilità significativi

13. B. atticus e B. whitei • Nessuna differenza significativa tra la diversità delle sequenze, a tutti i livelli di confronto • B. lynceorum • Anche suddividendo la variabilità nelle due componenti -atticus e -grandii non riscontro differenze significative

14. CONFRONTO INTERSPECIFICO • B. grandii VS B. atticus • B. grandii ha valori di diversità sequenza significativamente più bassi • Anche considerando B. grandii grandii, che dovrebbe essere più affine a B. atticus • B. grandii grandii VS B. whitei • Stesso livello di diversità sequenza • B. grandii grandii VS B. lynceorum • Differenze significative (come ci si aspetta per l’origine triibrida di B. lynceorum) • La diversità di sequenze non è significativa considerando il confronto con la componente -grandii • B. atticus VS B. lynceorum • Stesso pattern di diversità, con la componente -atticus

15. Discussione • Il bisessualeB. grandii mostra un pattern tipico di evoluzione concertata: maggiore omogeneità all’interno del pool della sottospecie. • Gli unisessuali mostrano la stessa variabilità ad ogni livello di confronto considerato • indipendentemente da meccanismo partenogenetico (auto o apomittico) o origine (ibrida o non) • la variabilità assoluta è particolarmente alta in B. atticus e nelle sequenze -atticus degli ibridi • Conferma ipotesi Dover (1986): la bisessualità agisce come forza di deriva nella fissazione delle sequenze ripetute, uniformando intra e creando discontinuità inter.

16. B. grandii maretimi • Ripetizioni molto divergenti in due individui • nuove varianti si stanno diffondendo nella popolazione. • fase mutazionale che conduce a una più bassa omogeneizzazione di varianti di sequenze preesistenti.  Incipiente stadio di speciazione

17. B. atticus • forse nell’assenza di anfimissi si ha mancanza di fissazione delle varianti. • Assenza di omogeneizzazione sequenze tra individui  partenogenesi rallenta i processi di turnover molecolare. • Datazione mitocondriale: l’antenato di B grandii grandii e B. atticus era contemporaneo dell’antenato comune al gruppo B. grandii, e i monomeri satellitari si sono allontanati in maniera uguale in questo periodo • contraddice ipotesi del rallentamento • suggerisce un’evoluzione confrontabile delle sequenze satellitari

18. B. atticus ha una diversità di sequenze molto più alta di B. grandii grandii, più alta di tutto il gruppo grandii • bisessualità porta una dinamica di fissazione e omogeneizzazione entro a tasso maggiore • limitata distribuzione spaziale di grandii grandii • taxon relitto, che nel passato aveva un areale più ampio • Le analisi su B. rossius (bisessuale ampiamente distribuito nel mediterraneo) indicano un’alta variabilità.  La scarsa variabilità di grandii quindi deriva più dalla sua storia evolutiva che dal tipo di riproduzione. • Grande omogeneità di sequenze di grandii come conseguenza del suo più alto numero di copie. • Meno copie, più eterogeneità in atticus • Collegamento con il numero e l’attività dei trasposoni, evoluzione concertata del DNA ripetuto in tandem, e tipo di riproduzione.

19. B. whitei • omogeneità di sequenza a tutti i livelli di confronto • Stessa variabilità riscontrata nell’attuale B. grandii grandii • Mancanza di nuova fissazione delle varianti nella riproduzione clonale e limitato effetto di meccanismi di turnover genomico • origine ibrida: da pochi incroci tra femmine rossius e maschi grandii grandii • All’epoca la variabilità di B. grandii grandii probabilmente si era già ridotta ai valori attuali • Confronto con B. atticus: assenza di correlazione tra partenogenesi e livello di variabilità dei satelliti (whitei ha valori bassi, atticus alti). • La riproduzione rispecchia la struttura della variabilità esistente in partenza.

20. B. lynceorum • origine contemporanea a B. whitei. • Riflette il livello di variabilità dei genitori nelle sequenze tipo-atticus e tipo-grandii. • Confermata l’esistenza di sequenze con tratti convertiti • La conversione genica è squilibrata: questo squilibrio col tempo può portare a omogeneizzazione intra. • tendenza alla speciazione e stabilizzazione di genomi allopoliploidi. • Plasticità mitotica dei tandem repeats

21. Conclusione • Gli unisessuali sono lontani dall’essere geneticamente uniformi, qualunque sia il tempo e l’estensione dei processi molecolari in un organismo partenogenetico. • Dietro i generali processi molecolari, tratti specifici dell’organismo sono profondamente coinvolti nella dinamica del DNA satellitare.